Expresión génica del sistema endocannabinoide en el endometrio a lo largo del ciclo menstrual

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 9400 (2022) Citar este artículo

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Los endocannabinoides intervienen en las funciones celulares y su actividad está controlada por un sistema complejo de enzimas, receptores de membrana y moléculas de transporte. Los endocannabinoides están presentes en el endometrio, un tejido regenerativo cíclico que requiere mecanismos celulares estrechamente regulados para su maduración. El objetivo de este estudio fue investigar la expresión génica de elementos clave involucrados en el sistema endocannabinoide a lo largo del ciclo menstrual. Se aisló el ARN del tejido endometrial y se generaron conjuntos de datos de expresión génica de todo el genoma mediante la secuenciación del ARN. Se seleccionó un conjunto a priori de 70 genes asociados con el sistema endocannabinoide de la literatura publicada. La expresión génica a lo largo del ciclo menstrual se analizó utilizando una prueba t moderada, corregida para pruebas múltiples con el método de Bonferroni. Un total de 40 de los 70 genes estaban presentes en > 90% de las muestras, y se identificó una expresión génica diferencial significativa para 29 genes. Identificamos 4 patrones de regulación distintos para sintetizar enzimas, así como un patrón de regulación distinto para degradaciones y enzimas transportadoras. Este estudio traza la expresión de los genes del sistema endocannabinoide endometrial a lo largo del ciclo menstrual. La expresión alterada de genes que controlan los endocannabinoides puede permitir un control preciso de las concentraciones de endocannabinoides y su influencia en la función celular, la maduración y la diferenciación a medida que el endometrio madura durante el ciclo menstrual.

Los endocannabinoides son pequeñas moléculas basadas en lípidos que desempeñan un papel fundamental en la regulación de las funciones celulares. Los endocannabinoides mejor caracterizados son la anandamida (AEA) y el 2-aracdonoilglicerol (2-AG). Su producción, concentración e influencia celular está mediada por una compleja interacción de proteínas que regulan su síntesis, transporte, unión a membrana, tráfico y degradación1. En conjunto, los endocannabinoides y estas proteínas se denominan sistema endocannabinoide (SEC)2. La expresión alterada de cualquier componente de ECS puede conducir a una variación en la actividad endocannabinoide y alterar su impacto en la función celular.

La síntesis y degradación de AEA implica una serie de enzimas. Se han informado cuatro rutas para la síntesis de AEA a partir de NAPE y la ruta más ampliamente aceptada es la síntesis directa de un solo paso por la enzima NAPE-PLD3,4,5,6. Las tres vías restantes son procesos de dos pasos que involucran a la fosfolipasa C (PLC) y la proteína tirosina fosfatasa N22 (PTPN22)7,8, la fosfolipasa A2 (PLA2) y la 2-lisofosfolipasa D (LysoPLD)9,10, y α/ β hidrolasa 4 (ABHD4) y glicerofosfodiéster fosfodiesterasa 1 (GDE1)11,12. La amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) es la principal enzima responsable de la degradación de AEA13,14. Además, la AEA está sujeta a la oxigenación por varias enzimas, incluidas la ciclooxigenasa-2 (COX-2)15,16, 5-, 12- y 15-lipoxigenasa (5-/12-/15-LOX)17,18, y varias monooxigenasas del citocromo P450 (P450), incluidas CYP3A4, CYP4F2, CYP4X1 y CYP2D619,20. Se han identificado dos vías sintéticas de dos pasos para la síntesis de 2-AG, e involucran a PLC21 seguida de sn-1-diacilglicerol lipasa (DAGL) o fosfolipasa A1 (PLA1) seguida de lisofosfolipasa C (liso-PLC)22, 23 El metabolismo del 2-AG involucra varias enzimas, incluida la principal enzima degradante monoacilglicerol lipasa (MAGL)21,24, FAAH, ABHD6 y ABHD1225, COX-2 y LOXs16,26.

Los endocannabinoides se encuentran en muchos órganos y tejidos, incluido el endometrio, e influyen en la migración celular27,28, la proliferación29, la supervivencia30, la inflamación31,32 y la diferenciación celular33. El endometrio recubre el útero y está compuesto por estructuras glandulares epiteliales, estroma vascularizado y células inmunitarias infiltrantes. Es único en el sentido de que experimenta un crecimiento cíclico, regeneración y muda cada mes. La maduración del endometrio durante el ciclo menstrual está controlada por las hormonas sexuales femeninas, pero también requiere respuestas celulares estrechamente reguladas para facilitar los cambios celulares y estructurales. La fase proliferativa está dominada por la proliferación celular impulsada por los estrógenos, la vascularización y la estimulación inmunitaria, mientras que la fase secretora está dominada por la decidualización de las células estromales mediada por progesterona, la remodelación vascular y la modulación de las células inmunitarias34. La regeneración del endometrio después de la menstruación está mediada por células madre y progenitoras adultas ubicadas en la capa basal del endometrio que proliferan, maduran y se diferencian a lo largo del ciclo menstrual35,36. El desprendimiento y el nuevo crecimiento cíclicos constantes crean el potencial mensual de errores en la replicación celular que pueden ser la base de anomalías endometriales permanentes o transitorias.

Los endocannabinoides se expresan abundantemente en el endometrio e influyen en la función celular endometrial. El endocannabinoide sintético, la metandamida, induce la migración de células del estroma endometrial27, y la AEA afecta tanto la proliferación celular como la diferenciación de una línea de células del estroma endometrial inmortalizado (St-T1b) y fibroblastos deciduales humanos de la placenta, lo que sugiere un papel crucial en la decidualización37,38,39. También se demostró que AEA influye en la migración en la línea de células epiteliales endometriales humanas inmortalizadas HEC-1B28. Las variaciones en las concentraciones de endocannabinoides pueden influir en la proliferación y diferenciación celular a medida que avanza el ciclo menstrual y madura el endometrio. Los genes dentro del ECS se reconocen cada vez más como objetivos para modular la actividad endocannabinoide para múltiples enfermedades reproductivas, incluidas la endometriosis, el aborto espontáneo, el embarazo ectópico, la preeclampsia y el cáncer de endometrio39,40. Aún no está claro cómo se modifican estos a lo largo del ciclo menstrual.

Presumimos que el ECS desempeña un papel en la función celular del endometrio, que se regulan a lo largo del ciclo menstrual y que esto puede tener implicaciones sobre cómo madura el endometrio. El objetivo de este estudio fue definir un conjunto a priori de genes ECS de la literatura, analizar su expresión de ARNm en tejido endometrial humano y determinar las variaciones en su expresión a lo largo del ciclo menstrual.

De los 70 genes seleccionados de una lista a priori para el examen, encontramos solo 1 gen sin expresión perceptible en ninguna muestra endometrial (PLA2G2E), 64 se expresaron en al menos 1 muestra con > 10 recuentos, 61 se expresaron en 3 o más muestras, 40 se expresaron en más del 90% de todas las muestras (Tabla complementaria S1). Las enzimas sintetizadoras representaron 45 de los genes investigados, 29 (64,4 %) de los cuales se expresaron en > 90 % de las muestras. Los genes de enzimas degradadoras de endocannabinoides representaron 12 de los genes investigados, de los cuales 8 (66,7 %) se expresaron en > 90 % de las muestras. Los genes que codifican proteínas de transporte representaron 7 de los genes investigados, de los cuales 2 se expresaron consistentemente en > 90 % de las muestras. Finalmente, se investigaron 6 genes para receptores de membrana endocannabinoides y solo uno de ellos se expresó en > 90% de las muestras. Centramos el análisis posterior en estos 40 genes expresados en> 90% de las muestras y sus patrones de expresión a lo largo del ciclo menstrual. La expresión media relativa de cada gen mostró una variación significativa (Fig. 1A) y un análisis de mapa de calor que graficaba la expresión génica contra el ciclo menstrual indicó que un alto grado de esta variabilidad podría explicarse por cambios asociados con la etapa del ciclo (Fig. 1B). Se enumeran los cinco genes más expresados a lo largo del ciclo menstrual (Tabla 1).

Expresión génica de genes ECS en el endometrio a lo largo del ciclo menstrual. (A) Usando 206 muestras de endometrio encontramos que de los 70 genes identificados a través de la literatura para funcionar como parte de ECS, 40 se expresaron en al menos el 90% de las muestras. El nivel de expresión de cada gen varió significativamente entre individuos y la expresión media varió entre genes. (B) Un análisis de mapa de calor que identifica la expresión relativa (cpm) de cada gen a lo largo del ciclo menstrual. La variación de etapa identificada para algunos de estos genes podría explicarse en parte por las diferencias que ocurrieron en la expresión a lo largo del ciclo menstrual. M = menstrual, EP = proliferativa temprana, MP = proliferativa media, LP = proliferativa tardía, ES = secretora temprana, MS = secretora media, LS = secretora tardía.

La endometriosis es una de las patologías endometriales más comunes que ocurre en 1 de cada 9 mujeres en edad reproductiva41,42 con sospecha de endometriosis, la indicación más común para la cirugía en esta cohorte. Para determinar si las patologías endometriales, como la endometriosis, podrían influir en la expresión del gen ESC endometrial, evaluamos las diferencias entre mujeres con y sin endometriosis. De las 206 muestras recolectadas, 143 fueron casos de endometriosis confirmados a partir de la inspección visual de la pelvis en la laparoscopia y 63 no tenían evidencia de endometriosis. Usando el conjunto a priori de genes seleccionados y comparando la expresión entre mujeres con y sin endometriosis, ningún gen mostró evidencia de una diferencia significativa de expresión cuando se ajustó para múltiples pruebas, ya sea en comparación entre sí y teniendo en cuenta el ciclo menstrual como una covariable (Tabla complementaria S2), o al comparar cada etapa del ciclo individualmente (Tabla complementaria S3–S8). Estudios previos sobre las diferencias de expresión génica en estas muestras no mostraron diferencias significativas en todo el genoma entre mujeres con y sin endometriosis43,44. Por lo tanto, en el análisis posterior de la expresión a lo largo de la etapa menstrual, evaluamos todas las muestras juntas, independientemente del estado de la endometriosis.

Realizamos 6 comparaciones de expresión génica entre las 7 etapas consecutivas de los ciclos menstruales, ajustando el valor de p para tener en cuenta las pruebas múltiples de genes múltiples y las pruebas de etapa del ciclo menstrual (Tabla complementaria S9–S14). Identificamos una diferencia significativa en 21 genes entre las 7 etapas consecutivas del ciclo menstrual. Usando un análisis de mapa de calor, comparamos la expresión de estos genes en todas las etapas y agrupamos aquellos que mostraron niveles similares de expresión y patrón de regulación, identificando cuatro patrones distintos de interés.

El primer grupo contenía cinco genes con una expresión génica media alta que aumentaba constantemente a lo largo del ciclo menstrual desde la etapa EP y alcanzaba su punto máximo en la etapa ES (PLA2G4A, PLCL1, PLCB1) o MS (PLCB4), seguido de una disminución en la expresión en la etapa LS (Fig. 2A). Se observaron aumentos significativos para PLCL1 entre la etapa MP a LP (p = 0,004) y la etapa LP a ES (p = 8,28 × 10−15), pero posteriormente se reguló negativamente en la etapa MS (p = 0,007). Hubo un aumento significativo en PLCB4 de la etapa LP a ES (p = 0,007) con un aumento adicional de la etapa ES a MS (p = 0,003). Se registró una diferencia significativa en la transición de la etapa ES a MS para PLCB1 (p = 1.31 × 10−11). Se observó una disminución significativa de PLA2G4A en la transición de la etapa MS a la etapa LS (p = 1,31 × 10−11).

El perfil de expresión de los cuatro grupos distintos de enzimas sintetizadoras de endocannabinoides. (A) El grupo 1 mostró una alta expresión génica (≈ 50–150 CPM) que aumentó a lo largo de la etapa proliferativa y alcanzó su punto máximo durante la etapa secretora temprana a la secretora media. (B) El segundo grupo se caracterizó por una expresión génica mediana (≈ 20–80 CPM) que generalmente aumentó desde la etapa menstrual hasta la proliferativa temprana y luego mostró una disminución gradual. (C) Este grupo se caracterizó por una expresión baja-media (≈ 10-80 CPM) que disminuyó en la etapa proliferativa temprana y aumentó posteriormente en la etapa secretora. (D) El cuarto grupo se caracterizó por una baja expresión génica (≈ 1–30 CPM) que mostró solo pequeños cambios en las etapas. M = menstrual, EP = proliferativa temprana, MP = proliferativa media, LP = proliferativa tardía, ES = secretora temprana, MS = secretora media, LS = secretora tardía.

El segundo grupo de genes se caracterizó por una expresión media moderada con una disminución gradual a lo largo del ciclo después de un pico inicial durante la etapa EP. Se observó una excepción con PLCB3 que mostró una expresión consistente a lo largo del ciclo alcanzando su punto máximo en la etapa de EM (Fig. 2B). Se observaron aumentos significativos en la expresión durante la transición de la etapa M a EP para PLCE1 (p = 0,004) y PLA2G12A (p = 0,001) que también mostró una disminución significativa de la etapa LP a ES (p = 0,007), así como la Etapa ES a MS (p = 1.44 × 10-8). También se observaron disminuciones significativas para GDE1 de la etapa LP a ES (p = 7,81 × 10−8) y para PLCB3 en la transición de la etapa MS a LS (p = 0,003).

El tercer grupo se caracterizó por una expresión media media y que disminuyó directamente después de la etapa menstrual y luego aumentó nuevamente después de la etapa ES (Fig. 2C). Se observaron disminuciones significativas en PLD1 en la transición de la etapa M a EP (p = 0,0005) y nuevamente de la transición LP a ES (p = 0,002). Se observó un aumento significativo para PLCG2 (p = 0,005) y PLCD3 (p = 8,01 × 10−5) durante la transición de LP a ES. PLD1 comenzó a aumentar en la etapa MS (p = 0,0003) continuando en la etapa LS (p = 2,8 × 10−8). Tanto PLCG2 (p = 0,005) como PLCD3 (p = 1,44 × 10−8) continuaron su aumento durante la etapa secretora temprana a media.

El grupo final se caracterizó por una expresión media baja que mostró cambios de expresión múltiples y variados a lo largo de la etapa EP a ES (Fig. 2D). Se observaron diferencias significativas para los genes individuales entre la etapa M a EP para DAGL que aumentó (p = 0,003) y PTPN22 que disminuyó (p = 0,003). Hubo una regulación mínima en la etapa proliferativa, sin embargo, en la transición de la etapa LP a ES hubo una disminución en GDE4 (p = 5,48 × 10−5), PLCL2 (p = 0,007) y un aumento en GDE7 (p = 2,93). × 10−11), ABHD4 (p = 0,002), PLCH2 (p = 0,0001) y PLA2G6 (p = 0,007). También ocurrieron cambios significativos en la etapa ES a MS con una reducción en PLCH2 (p = 2.19 × 10−16), DAGL (p = 0.0004), GDE7 (p = 0.0009) y un aumento en PLCB2 (p = 0.002) y PTPN22 (p = 0,001). NAPE-PLD disminuyó de MS a LS (p = 0,003). Finalmente, PLCH2 (p = 0,003), PTPN22 (p = 0,0002) y GDE4 (p = 0,003) aumentaron significativamente en LS en comparación con la etapa de MS.

Identificamos 7 genes conocidos por codificar proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) que transportan endocannabinoides intracelularmente. Los cambios más grandes se observaron para FABP5, que aumentó significativamente desde la etapa LP a ES (p = 0,002) (Tabla complementaria S12) con una posterior regulación descendente desde la etapa MS a LS (p = 0,01) (Fig. 3A) (Suplementario Tabla S14). FABP3 se reguló significativamente en la transición de la etapa ES a MS (p = 0.0005) (Tabla complementaria S13).

El perfil de expresión de genes que codifican proteínas de transporte y degradación de ECS. La expresión de transcripción que mostró una diferencia significativa en cualquier etapa del ciclo menstrual se representó frente a la etapa del ciclo. (A) Para las proteínas transportadoras, se observó una expresión moderada de FABP5 y FABP3 que aumentó significativamente a lo largo del ciclo menstrual. (B) Las enzimas degradantes de ECS tenían una expresión de moderada a baja que se alteraba más comúnmente entre la etapa menstrual y proliferativa temprana, o durante el período desde la etapa proliferativa tardía hasta la etapa secretora media. Dos genes ABHD12 y NAAA mostraron un aumento constante durante la etapa proliferativa, después de lo cual hubo una disminución en la expresión. M = menstrual, EP = proliferativa temprana, MP = proliferativa media, LP = proliferativa tardía, ES = secretora temprana, MS = secretora media, LS = secretora tardía.

Identificamos la expresión de 8 de los 12 genes relacionados con la degradación de endocannabinoides en el tejido endometrial. De estos, ALOX5 (p = 0,0005) y COX-2 (p = 0,008) se redujeron significativamente y NAAA se reguló significativamente en la transición de la etapa M a la etapa EP (p = 0,008) (Fig. 3B) (Tabla complementaria S9) . En la transición de la etapa LP a ES, FAAH disminuyó (p = 0,002) y ABHD12 aumentó (p = 0,001) (Fig. 3B) (Tabla complementaria S12). En contraste, en la etapa ES a MS, FAAH se reguló al alza (p = 0.0003) y ABHD12 se reguló a la baja (p = 0.004) (Tabla complementaria S13). Otros cambios significativos de la etapa ES a la MS incluyeron; NAAA (p = 5,04 × 10−7) y COX-2 (p = 1,15 × 10−6) que estaban regulados a la baja y ALOX5 (p = 0,0002) que estaban regulados al alza.

Evaluamos la expresión génica de 6 receptores de membrana ECS a lo largo del ciclo menstrual y entre estados de endometriosis. De estos 6 genes, encontramos que solo uno, TRPV1, se expresó en> 90% de las muestras. Tenía una expresión baja pero constante y no estaba significativamente regulada a lo largo del ciclo menstrual ni influida por el estado de la endometriosis. La expresión de todos los demás receptores de membrana se produjo en < 90 % de las muestras. Esto sugiere una expresión constantemente baja por debajo de la profundidad de lectura o una regulación binaria de encendido/apagado. Con base en el potencial de regulación binaria, determinamos el porcentaje de muestras que expresan genes de receptores de membrana en cada etapa menstrual (Fig. 4). Tanto para CNR1 como para CNR2, el número de muestras con expresión positiva estuvo entre el 70 y el 100% para las distintas etapas del ciclo, disminuyendo durante la etapa proliferativa con un aumento posterior durante la etapa secretora. Sin embargo, los cambios no alcanzaron significación. La expresión de GPR55 se produjo en aproximadamente el 70 % de las muestras, y también disminuyó a lo largo de la etapa proliferativa, alcanzando un mínimo durante la etapa ES y aumentando posteriormente durante las etapas MS a LS. La expresión de TRPA1 se observó solo entre la etapa MP y MS y solo en un bajo número de muestras. El análisis estadístico reveló que no hubo diferencias significativas para ningún receptor endocannabinoide en las diferentes etapas del ciclo menstrual. Además, no se observaron diferencias en el porcentaje de muestras que expresaban cualquiera de los receptores de membrana cuando se comparaba el estado de la endometriosis y se ajustaba por la fase del ciclo menstrual.

Análisis de regresión logística del receptor endocannabinoide. Cuatro de los cinco receptores endocannabinoides no mostraron una expresión uniforme por encima del 90 % en todas las muestras. Un análisis de regresión logística que examinó el porcentaje de muestras que mostraban una expresión positiva mostró una variación significativa a lo largo del ciclo menstrual para CNR1, CNR2 y GPR55. Solo un pequeño número de muestras expresó TRPA1 y esto se limitó al período entre la etapa proliferativa media y la etapa secretora media. M = menstrual, EP = proliferativa temprana, MP = proliferativa media, LP = proliferativa tardía, ES = secretora temprana, MS = secretora media, LS = secretora tardía.

Los datos de micromatrices estaban disponibles en un subconjunto de muestras (n = 161). Se detectaron 35 de los 40 genes en al menos el 50 % de las muestras de micromatrices y se incluyeron en el análisis para garantizar suficientes comparaciones por pares para estimar una correlación precisa. Usando la función 'cor.test' en R, estimamos la correlación de Pearson entre los recuentos normalizados y corregidos por lotes de RNA-Seq (log2-CPM) y microarray (señal normalizada log2) para cada gen en las 161 muestras. Los 35 genes detectados se correlacionaron positivamente con un valor de correlación medio de 0,62, lo que confirma una medición robusta de la expresión génica mediante la técnica RNA-seq, a pesar de las diferencias entre microarray y RNA-seq, incluida la incapacidad de microarray para medir todas las variaciones de transcripción y detección diferente. umbrales (Tabla complementaria S15).

Los endocannabinoides, lípidos sintetizados naturalmente, se producen en abundancia en el tracto reproductivo femenino45. Están presentes en el endometrio normal e influyen significativamente en la maduración y función celular46. La modulación del sistema ECS ocurre a través de enzimas que regulan la producción, el transporte y la degradación de las moléculas de señalización endocannabinoides. Comprender la expresión enzimática puede proporcionar información sobre cómo se modulan los niveles de endocannabinoides en el endometrio. Utilizando datos de expresión génica de todo el genoma de muestras endometriales, realizamos un análisis exhaustivo de la expresión génica de ECS durante el ciclo menstrual. Identificamos una regulación significativa a lo largo del ciclo menstrual para muchos genes e identificamos distintos patrones de regulación que respaldan fuertemente la alteración en la actividad endocannabinoide a lo largo del ciclo menstrual que podría ser tanto una consecuencia como una contribución a los cambios que ocurren durante la maduración endometrial cíclica.

Las enzimas capaces de sintetizar la producción de endocannabinoides fueron las más abundantes en el endometrio y también mostraron el mayor nivel de regulación del ciclo menstrual. La mayoría de los cambios en la expresión génica ocurrieron durante la transición de la etapa proliferativa tardía a la etapa secretora temprana y continuaron a lo largo de la etapa secretora. La transición de la etapa proliferativa a la secretora se caracteriza por la ovulación y un aumento en la producción de progesterona. Los niveles de progesterona también fluctúan durante la etapa secretora aumentando hasta la etapa secretora media y disminuyendo durante la etapa secretora tardía34. Los cambios en la expresión génica a lo largo del ciclo sugieren un papel importante de las hormonas esteroides en la modulación del ECS, en particular la progesterona. Estudios previos han informado que la progesterona está involucrada en el mantenimiento de los niveles de endocannabinoides del endometrio47. Se descubrió que la progesterona induce la expresión de CB1 en las células del estroma endometrial31 y activa el promotor FAAH disminuyendo los niveles de AEA en los linfocitos T humanos48. En ratones, se ha demostrado que la progesterona regula a la baja la expresión uterina de NAPE-PLD, lo que posiblemente conduce a una disminución de los niveles de AEA49. Aunque por el contrario, un estudio no informó correlación entre los niveles plasmáticos de AEA y progesterona en mujeres ciclistas normales50.

Los endocannabinoides más abundantes en el endometrio, AEA y 2-AG, se sintetizan predominantemente a través de NAPE-PLD y DAGL, respectivamente1, y representan dos de las enzimas más importantes del SEC. Encontramos que ambas enzimas estaban reguladas a la baja durante la transición de la etapa menstrual a la proliferativa temprana y luego subsiguientemente reguladas al alza desde la etapa secretora temprana a la intermedia y nuevamente desde la etapa secretora media a la tardía. Esto sugiere una mayor capacidad para la producción de endocannabinoides a medida que avanza el ciclo menstrual. Es posible que esta mayor capacidad no esté relacionada con la progesterona, ya que disminuye hacia el final del ciclo, un período en el que la capacidad de producción de endocannabinoides sigue aumentando. Un estudio anterior informó que la inmunorreactividad de NAPE-PLD aumentó en las glándulas menstruales, proliferativas tempranas y secretoras tardías con sus niveles más bajos en la fase secretora temprana51. En un modelo de ratón, se informó que la progesterona disminuye la expresión de NAPE-PLD49. El aumento de estas enzimas y el aumento potencial de los endocannabinoides pueden tener implicaciones para la función y diferenciación celular durante el ciclo menstrual en humanos y roedores.

Varias otras enzimas pueden regular la producción de endocannabinoides a través de vías alternativas. Uno de estos grupos incluye las muchas isoformas de la fosfolipasa C (PLC). Los PLC catalizan selectivamente la degradación de fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato que da como resultado inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) soluble y 1,2 diacilglicerol (DAG)52 delimitado por membrana. DAG es un importante precursor de 2-AG53. Observamos patrones múltiples, pero distintos, de regulación de PLC a lo largo del ciclo menstrual, particularmente durante la transición de la etapa proliferativa a la secretora. Esta regulación afectaría la expresión de DAG, lo que posteriormente influiría en la producción de 2-AG. No está claro en este estudio si cada una de estas isoformas tiene una eficacia similar en el metabolismo de IP3 y la subsiguiente producción de DAG en el endometrio.

Los endocannabinoides continúan ejerciendo su actividad hasta que se degradan. Varias enzimas responsables de la degradación de los endocannabinoides, incluidas FAAH, MGLL y ABHD12, también se redujeron significativamente durante la transición de la etapa proliferativa tardía a la etapa secretora temprana. Una regulación a la baja de estas enzimas potenciaría la capacidad de los endocannabinoides para continuar la señalización. De estas enzimas, FAAH es de particular interés. FAAH es una enzima principal en la degradación de AEA y la evidencia previa sugiere una relación con la progesterona54,55. FAAH se ha implicado previamente en la supervivencia de las células del estroma endometrial de las lesiones de endometriosis ectópica56 y ha recibido un interés significativo como diana farmacológica, modulando el dolor a través de mecanismos tanto periféricos como centrales57. Las concentraciones fisiológicas de progesterona estimularon la actividad FAAH en los linfocitos humanos, disminuyendo los niveles de AEA48,54,58, mientras que en un modelo de ratón se informó que la progesterona disminuye la actividad FAAH uterina59. Los niveles de progesterona y la expresión de FAAH se han correlacionado durante el ciclo menstrual60, de acuerdo con el hallazgo de que la progesterona aumenta la expresión del gen FAAH48,58. Combinado con la regulación de las PLC durante este período, esto sugiere una regulación estricta de la renovación de endocannabinoides durante la transición entre las etapas del ciclo menstrual.

Factores adicionales, además de su producción e inhibición, pueden influir en las concentraciones de endocannabinoides y su actividad. La degradación intracelular depende de que el endocannabinoide lipofílico llegue a las enzimas intracelulares. Uno de los cambios más significativos que observamos en este conjunto de genes fue la regulación de FABP5 a lo largo del ciclo menstrual. FABP5 es una proteína de unión a ácidos grasos que transporta endocannabinoides a través del entorno celular acuoso, dirigiéndolos preferentemente hacia FAAH61. FABP5 también se reguló significativamente durante la transición de la etapa proliferativa tardía a la etapa secretora temprana. Una reducción en el transporte hacia la enzima degradante podría potenciar la presencia de los endocannabinoides durante este período y puede contribuir a cambios celulares e inflamatorios34,62 que permiten la regeneración del endometrio en la fase secretora temprana y media en ciclos no conceptuales.

Aunque incluimos una extensa lista de genes que codifican receptores endocannabinoides, incluidos CNR1, CNR2, TRPV1, TRPA1, GPR55 y GPR119, descubrimos que solo uno de estos (TRPV1) se expresó de manera consistente en > 90 % de las muestras. Se demostró previamente que tanto CNR1 como CNR2 se expresan en el endometrio con variación en la expresión entre mujeres con y sin endometriosis31. Encontramos expresión en la mayoría de las muestras, pero no lo suficiente como para alcanzar el límite > 90 %. El análisis de la expresión génica de los receptores restantes como variable binaria encontró cambios a lo largo del ciclo menstrual. Aunque no encontramos ninguno que alcanzara significación después de múltiples pruebas, esto puede estar relacionado con el poder del tamaño de la muestra o el entorno complejo de tipos de células individuales y estados de células en maduración que existen dentro del endometrio en cualquier momento. Los resultados mostraron cambios no significativos en el número de muestras que expresaban CNR1, CNR2 y GPR55 durante el período proliferativo tardío al secretor temprano. Si bien se descubrió que el receptor CB1 (la proteína codificada por el gen CNR 1) inhibe la decidualización humana y estimula la apoptosis38, los estudios sobre la expresión de CB1 en las glándulas epiteliales no encontraron una regulación significativa a lo largo del ciclo menstrual51, y la expresión de CB2 en las células del estroma fue similar entre los proliferativa y la fase secretora30. Estudios previos también informaron que la progesterona ejerció efectos mínimos sobre la expresión de CB1 en linfocitos48,54,58. Por lo tanto, es probable que la falta de cambios significativos en la expresión de estos receptores en las muestras y en el ciclo menstrual indique que es posible que no estén regulados significativamente por las hormonas reproductivas en el tejido endometrial. La capacidad de estos genes para activarse o desactivarse puede reflejar el uso selectivo en pacientes, depende de los requisitos locales y proporciona la capacidad de ajustar la actividad del ECS.

De nuestra cohorte de estudio, 143 (69,4%) fueron diagnosticadas con endometriosis. Estudios previos sobre el ECS en mujeres con endometriosis han mostrado resultados contradictorios. Uno no informó diferencias significativas en la expresión de NAPE-PLD y FAAH en el endometrio de pacientes en comparación con mujeres sin endometriosis a lo largo del ciclo menstrual63. Otro estudio no informó diferencias en la expresión de la proteína CB1 durante la fase proliferativa entre pacientes con y sin endometriosis63, mientras que se informaron niveles más bajos de CNR1 y la proteína CB1 en el tejido endometrial de mujeres con endometriosis en comparación con los controles, independientemente de la fase del ciclo31. Tampoco se ha informado ninguna diferencia en la expresión de TRPV1 entre mujeres con y sin endometriosis a lo largo del ciclo menstrual63. En este estudio actual, al tener en cuenta la etapa menstrual y las pruebas múltiples, no encontramos diferencias significativas en ninguno de los genes ECS investigados entre mujeres con y sin endometriosis. Por lo tanto, nuestros datos se correlacionan con los datos publicados anteriormente que muestran que el ECS no está significativamente desregulado en el tejido endometrial eutópico de pacientes con endometriosis.

Esta es la mayor cantidad de muestras endometriales utilizadas para investigar la expresión génica del ECS a lo largo del ciclo menstrual, y las muestras se asignaron a 7 etapas menstruales detalladas siguiendo los criterios de Noyes. Sin embargo, la distribución de muestras a lo largo de las etapas menstruales varió y los resultados deben interpretarse con precaución cuando los tamaños de muestra para las etapas menstruales fueron pequeños. Si bien pudimos analizar la mayoría de los ECS a nivel de genes con datos de RNA-seq, aún tenemos que traducir esto a proteínas. Las diferencias en la expresión de genes y proteínas se identifican comúnmente, lo que probablemente se replique en el sistema ECS. Nuestro objetivo es generar una imagen verdaderamente representativa del ECS a nivel de proteína una vez que se hayan recolectado suficientes muestras y recursos.

En resumen, hemos utilizado la expresión génica de todo el genoma para investigar un conjunto de genes predefinido específico en función de su participación previamente identificada en el ECS. El análisis dirigido de un conjunto de genes definido reducirá la carga de múltiples pruebas en datos de expresión génica de tamaño modesto, lo que brinda el potencial para descubrir variaciones sutiles. Detectamos diferencias en la expresión génica a lo largo del ciclo menstrual que son más pronunciadas durante la transición de la etapa proliferativa a la secretora y reflejan un potencial para modular dinámicamente las concentraciones de endocannabinoides durante este período. Dado que la actividad de los endocannabinoides es rápida y de corta duración, especulamos que la regulación alterada de la expresión de muchos componentes del ECS a lo largo del ciclo menstrual proporciona un potencial de ajuste fino y de acción rápida para modular la expresión de endocannabinoides según sea necesario, particularmente durante el período de transición en el que el endometrio sufre una importante reorganización estructural. De particular interés, notamos los grandes cambios en varias enzimas PLC y la variación significativa en FAAH y FABP5 que trabajan en conjunto para desactivar la actividad endocannabinoide y ya están recibiendo una atención considerable como objetivos de fármacos para el dolor, la inflamación y el cáncer64,65. La importante capacidad de regulación de los receptores endocannabinoides también puede tener un interés particular por el potencial de la orientación selectiva de los pacientes y la personalización de la medicación.

Las muestras se recolectaron como se describió anteriormente (n = 206) 43 y los criterios de inclusión fueron ascendencia europea y edad reproductiva (18–49, media = 31,85). Los criterios de exclusión fueron el uso de medicamentos hormonales dentro de los 3 meses previos a la cirugía, anomalías en el examen histopatológico, estado ambiguo de la enfermedad o etapa del ciclo menstrual. El consentimiento informado se obtuvo de todos los temas. Se realizó una evaluación histológica en tejido embebido en parafina fijado en formalina con cada muestra asignada a 1 de 7 posibles etapas menstruales siguiendo los criterios de Noyes66: menstrual (M) (n = 14), proliferativa temprana (EP) (n = 5), proliferativa media (MP) (n = 72), proliferativa tardía (LP) (n = 22), secretora temprana (ES) (n = 31), secretora media (MS) (n = 41) y secretora tardía (LS) (n = 21) (Fig. 1 complementaria). Si se observaba endometriosis durante la cirugía laparoscópica, se extirpaban las lesiones y se enviaban a patología para confirmación histopatológica (n = 143 casos de endometriosis y n = 63 controles sin endometriosis). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Humana (HREC) del Royal Women's Hospital (Proyectos 11-24 y 16-43 y Melbourne IVF Project 05-11) y la Universidad de Queensland HREC (2016000746), y todos los experimentos fueron realizado de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

El ARN total se aisló de biopsias endometriales almacenadas en RNAlater utilizando el Allprep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante y las muestras de ARN aislado se trataron con el kit Turbo DNA-free (Thermo Fischer Scientific, EE. UU.). La calidad del ARN se confirmó utilizando el Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, EE. UU.) con valores de corte del número de integridad del ARN (RIN) establecidos por encima de 8 para la inclusión y las concentraciones finales de ARN determinadas por el Nanodrop ND-6000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las bibliotecas de secuenciación de ARN trenzado (RNA-seq) se prepararon con el protocolo Illumina TruSeq Stranded Total RNA Gold que incorpora el agotamiento ribosómico (Illumina, EE. UU.). Las bibliotecas resultantes se agruparon y secuenciaron con lecturas de extremos emparejados de 75 pb en Illumina HiSeq 4000 a una profundidad media de 37 490 673 para 178 muestras y con lecturas de extremos emparejados de 120 pb en Illumina Hi Seq 2000 (Illumina, EE. UU.) profundidad de 40,818,062 lecturas para 28 muestras.

La calidad de las lecturas de RNA-seq sin procesar se confirmó con FastQC v0.11.767 y MultiQC v1.668. Las lecturas de baja calidad o las lecturas que contenían secuencias del adaptador HiSeq Illumina se recortaron con Trimmomatic v0.3669. Las lecturas recortadas resultantes se alinearon con un ensamblaje de referencia (Ensembl Homo sapiens GRCh38 versión 91) con HISAT2 v2.0.5 y el ensamblaje de la transcripción se realizó con StringTie v1.3.170,71 y se contó cada lectura asignada a una transcripción conocida. Las matrices de transcripción, exón y expresión en fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM) se determinaron con recuentos StringTie para cada individuo. Antes de la normalización de los recuentos de RNA-seq, se eliminaron los genes de baja expresión (recuentos por millón (CPM) < 0,22) y expresados en < 90 % de las muestras. Los recuentos de genes se normalizaron para el sesgo de composición y las lecturas sin procesar totales utilizando TMM72,73,74 en el paquete edgeR R v 3.22.375. Los recuentos normalizados se convirtieron a CPM y se transformaron en log2 (log2-CPM).

La selección de genes a priori se realizó a través de una búsqueda bibliográfica utilizando el término de búsqueda 'endocannabinoide' y combinaciones de 'vía', 'síntesis', 'metabolismo', 'transporte' o 'endometrio'. Todos los genes relevantes para el control del SEC se catalogaron mediante el ID de expresión génica de ENSEMBL y la expresión génica se extrajo de la base de datos seleccionada. Los genes ECS de interés se dividieron en cuatro categorías en función de su función principal en el ECS, incluidas (i) enzimas sintetizadoras, (ii) receptores, (iii) transportadores y (iv) enzimas de degradación. En total, se evaluaron 70 genes potenciales que se sabe que desempeñan un papel en el ECS (Tabla complementaria 1).

Se investigó la expresión génica diferencial tanto a lo largo del ciclo menstrual como en mujeres con y sin endometriosis. Solo se analizaron los genes con CPM > 0,22 en al menos el 90 % de las muestras para determinar la expresión diferencial. Se realizaron siete comparaciones de expresiones génicas diferenciales a lo largo del ciclo menstrual: (i) entre M y EP, (ii) entre EP y MP, (iii) entre MP y LP, (iv) entre LP y ES, (v) entre ES y MS, (vi) entre MS y LS y (vii) entre MP y MS. Se realizaron siete comparaciones de expresiones génicas diferenciales entre mujeres con y sin endometriosis: (i) incluida la etapa del ciclo menstrual como covariable, (ii) dentro de M, (iii) dentro de MP, (iv) dentro de LP, (v) dentro de ES, (vi) dentro de MS y (vii) dentro de LS. Los efectos por lotes (celda de flujo y carril) se ajustaron como covariables en todos los modelos. La función voom en limma76 se utilizó para transformar los recuentos normalizados en recuentos de registro por millón con pesos de precisión asociados antes del modelado lineal. Las comparaciones por pares descritas anteriormente se realizaron utilizando el método eBayes mediante el cual se estima una estadística t moderada y probabilidades logarítmicas de expresión diferencial para cada gen para cada contraste. Los valores de p se ajustaron para la cantidad de genes probados y para la comparación de comparaciones de etapas de ciclos múltiples utilizando Benjamini-Hochberg con un umbral de significación de 0.05. Los datos subyacentes a este artículo están disponibles en el artículo y en su material complementario en línea.

En el caso de los receptores de membrana donde la expresión génica positiva fue consistentemente < 90% de las muestras, exploramos la expresión génica como una función binaria de expresado/no expresado y realizamos un análisis de regresión logística como se describió anteriormente43 para determinar si hubo una variación significativa en el número de muestras que muestran una expresión positiva de estos genes a lo largo del ciclo menstrual.

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Descargar referencias

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Keisuke Tanaka y Akwasi A. Amoako

Facultad de Medicina, Universidad de Queensland, Herston, QLD, 4006, Australia

Keisuke Tanaka y Akwasi A. Amoako

Instituto de Biociencia Molecular, Universidad de Queensland, Santa Lucía, QLD, 4072, Australia

Sally Mortlock, Grant W. Montgomery y Brett McKinnon

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Peter AW Rogers, Sarah J. Holdsworth-Carson, Jacqueline F. Donoghue y Wan Tinn Teh

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Peter AW Rogers, Sarah J. Holdsworth-Carson y Jacqueline F. Donoghue

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Sarah J. Holdsworth-Carson

Departamento de Investigación Biomédica, Universidad de Berna, Murtenstrasse 35, 3010, Berna, Suiza

Brett McKinnon

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KT, AAA, GWM y BM fueron los responsables de la concepción y el diseño del presente estudio. PAWR, SJH, JFD y WTT adquirieron los datos clínicos y quirúrgicos. PAWR, SJH, JFD y WTT adquirieron los datos histológicos y de ARN. SM fue responsable del análisis estadístico. Todos los autores redactaron el trabajo y lo revisaron críticamente en busca de contenido intelectual importante. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Correspondencia a Keisuke Tanaka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Tanaka, K., Amoako, AA, Mortlock, S. et al. Expresión génica del sistema endocannabinoide en el endometrio a lo largo del ciclo menstrual. Informe científico 12, 9400 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13488-4

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Recibido: 16 noviembre 2021

Aceptado: 13 de mayo de 2022

Publicado: 07 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13488-4

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