Un mecanismo de retroalimentación desadaptativo entre la matriz extracelular y el citoesqueleto contribuye a la fisiopatología de la miocardiopatía hipertrófica

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 4 (2023) Citar este artículo

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La miocardiopatía hipertrófica es un trastorno hereditario debido a mutaciones en las proteínas contráctiles que da como resultado un miocardio rígido e hipercontráctil. Para comprender el papel de la rigidez cardíaca en la progresión de la enfermedad, aquí creamos un modelo in vitro de miocardiopatía hipertrófica utilizando tecnología de hidrogel. Cultivar miocitos cardíacos de tipo salvaje en hidrogeles con módulos de Young (rigidez) que simulan miocardiopatía hipertrófica es suficiente para inducir un estado mitocondrial hipermetabólico frente a miocitos en placas en hidrogeles que simulan un miocardio sano. Significativamente, estos datos reflejan los de los miocitos aislados de un modelo murino de miocardiopatía hipertrófica humana (cTnI-G203S). Por el contrario, la función mitocondrial de los miocitos cTnI-G203S se restablece por completo cuando se depositan en hidrogeles que imitan el miocardio sano. Identificamos un mecanismo de retroalimentación de mecanodetección entre la matriz extracelular y la red del citoesqueleto que regula la función mitocondrial en condiciones saludables, pero participa en la progresión de la fisiopatología de la miocardiopatía hipertrófica resultante de mutaciones del gen sarcomérico. Es importante destacar que identificamos sitios clave de 'enlazador' en este esquema que pueden representar posibles objetivos terapéuticos.

La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad cardíaca genética autosómica dominante que afecta a 1:500 de la población general1. Es la principal causa de muerte súbita cardiaca en jóvenes (5-15 años)2. La MCH se produce predominantemente debido a mutaciones genéticas en las proteínas sarcoméricas3,4. Las características clínicas de la MCH incluyen hipertrofia ventricular izquierda en ausencia de carga hemodinámica aumentada y ventrículo izquierdo no dilatado con fracción de eyección conservada o aumentada1,4. A nivel celular, la MCH se caracteriza por la remodelación de los miocitos cardíacos, la desorganización de las proteínas sarcoméricas, la fibrosis intersticial y la alteración del metabolismo energético5. Hemos identificado previamente un papel para el canal de calcio tipo L cardíaco (LTCC) en el desarrollo de la fisiopatología de la MCH6,7.

El LTCC cardíaco desencadena la "liberación de calcio inducida por calcio" que es fundamental para mantener el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca8. El LTCC cardíaco también juega un papel importante en la regulación de la función mitocondrial a través de mecanismos dependientes e independientes del calcio9,10. En concreto, la activación del LTCC provoca un aumento del potencial de membrana mitocondrial (Ψm), en presencia o ausencia de calcio9. Esto se ve facilitado por una asociación estructural-funcional entre el canal y las mitocondrias. El LTCC cardíaco es una proteína transmembrana compuesta por subunidades α1C, α2δ y β2. La subunidad β2 está unida a la subunidad α1C formadora de poros a través del dominio de interacción α (AID)11. La subunidad β2 también se asocia con la proteína asociada a la diferenciación de neuroblastos AHNAK, también conocida como desmoyoquina, una proteína subsarcolémica grande, que también está anclada a la actina F12. Las proteínas del citoesqueleto, incluida la actina F, interactúan directamente con las mitocondrias al unirse a las proteínas de acoplamiento mitocondriales externas13,14,15. Este vínculo estructural entre el LTCC y las mitocondrias juega un papel importante en la regulación de la función mitocondrial en condiciones fisiológicas, con cambios conformacionales que ocurren en la subunidad β2 del LTCC latido a latido que conducen a alteraciones posteriores en la función mitocondrial9.

Las alteraciones de esta red intracelular están asociadas con la desregulación de la función mitocondrial y el desarrollo de estados patológicos6,7,16,17. Hemos demostrado previamente que un modelo murino de MCH humana que causa la mutación del gen de la troponina I (cTnI) Gly203Ser (cTnI-G203S) muestra una arquitectura citoesquelética alterada, una comunicación estructural-funcional alterada entre el LTCC y las mitocondrias, y un estado mitocondrial hipermetabólico resultante6,17 . Se han registrado hallazgos similares en ratones portadores de la enfermedad humana que causa la mutación de cadena pesada de β-miosina Arg403Gln7. En particular, estas respuestas precedieron al desarrollo del estado hipertrófico.

El fenotipo establecido de MCH humana se caracteriza por un miocardio rígido18,19. De acuerdo con esto, el aumento de la síntesis de proteínas de la matriz extracelular (MEC) se ha implicado en la progresión de la patología de la MCH humana20,21,22. De hecho, los tejidos cardíacos creados mediante la siembra de miocitos cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos sanos en tiras de miocardio descelularizado extraído de un modelo porcino de MCH muestran una mayor rigidez21. La ECM interactúa con los miocitos cardíacos a través de la integrina de la proteína mecanosensora transmembrana, que también se ha implicado en el desarrollo de la hipertrofia cardíaca23,24. La proteína citosólica vinculina media la unión de la integrina a la actina F y transfiere fuerzas mecánicas desde la membrana celular al citoesqueleto23,25,26. Por lo tanto, además de una red intracelular entre el LTCC y las mitocondrias, también parece existir una asociación estructural-funcional entre la ECM y la actina F. Aquí exploramos el papel de este enlace en el desarrollo de la fisiopatología de la MCH que implica el LTCC y las mitocondrias mediante la creación de una plataforma in vitro que imita la rigidez miocárdica de la MCH.

Intentamos desarrollar un modelo in vitro de miocardiopatía hipertrófica. Comenzamos evaluando los módulos de compresión de Young (rigidez) de los hidrogeles producidos para imitar el miocardio sano ("blando") y el miocardio HCM ("rígido"). Usando microscopía de fuerza atómica, la rigidez compresiva general de los hidrogeles se registró en 12,5 ± 0,4 y 34,1 ± 0,9 kPa respectivamente (p <0,05, Fig. 1b). Luego utilizamos una línea celular de mioblastos H9C2 aislada de tejido ventricular de rata para probar nuestra plataforma in vitro. Las células H9C2 se colocaron en placas sobre sustratos de hidrogel recubiertos con laminina de proteína ECM. Las células H9C2 sembradas en hidrogeles rígidos mostraron un aumento significativo en la rigidez a la compresión en comparación con los hidrogeles blandos (p <0.05, Fig. 1a complementaria). Además, los estudios de inmunohistoquímica revelaron un aumento significativo en la lamina A, un marcador celular de rigidez, así como en la proteína de detección mecánica vinculina (p < 0.05, Figura complementaria 1b-e)27,28,29. Estos datos indican que alterar la rigidez compresiva de la plataforma de hidrogel fue suficiente para alterar la rigidez de las celdas.

un esquema que indica el vínculo estructural-funcional entre el canal de calcio tipo L, la red del citoesqueleto y las mitocondrias en miocitos cardíacos wt. Sitios de enlace dirigidos (1) dominio de interacción α (AID) del canal de calcio tipo L, (2) sitio de interacción entre la subunidad β2 del canal de calcio tipo L y AHNAK, (3) actina F, (4) tubulina β, y (5) integrina β1. b Rigidez a la compresión (en kPa) de hidrogeles de poliacrilamida (PA) en condiciones de fabricación (blando y rígido), incluida la media ± SEM. c Rigidez a la compresión (en kPa) de miocitos cardíacos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos, incluida la media ± SEM. Imágenes representativas y puntos de datos cuantificados para miocitos cardíacos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos teñidos para lámina A (d, e), vinculina (f, g) e integrina (h, i), incluida la media ± SEM. n = número de células, N = número de hidrogeles. Significación estadística determinada por las pruebas de Mann Whitney.

A continuación, realizamos estudios en miocitos cardíacos aislados de ratones de tipo salvaje (wt) de 10 a 15 semanas de edad. Los miocitos sembrados en sustratos de hidrogel rígidos y blandos recubiertos con laminina produjeron una rigidez de aproximadamente 2 y 4 kPa respectivamente (p < 0,05, Fig. 1c). Es importante destacar que estos valores se alinean con las mediciones previamente informadas de rigidez miocárdica evaluadas en adultos sanos y con MCH de 20 a 40 años18. Los miocitos sembrados en hidrogeles rígidos también mostraron un aumento significativo en lamina A, vinculina e integrina β1, la isoforma de integrina más abundantemente expresada en el corazón posnatal23,30 (p <0.05, Fig. 1d-i). Estos datos indican que nuestra plataforma in vitro es adecuadamente representativa de la condición humana.

Hemos demostrado previamente que los miocitos cardíacos cTnI-G203S exhiben una mayor actividad metabólica mitocondrial y Ψm que es consistente con la condición humana31, en respuesta a la activación del LTCC6,17. Aquí, exploramos si simplemente sembrar miocitos cardíacos wt en hidrogeles con una rigidez que imitaba el miocardio HCM era suficiente para reflejar estas respuestas. Probamos el efecto de la rigidez del sustrato sobre la actividad metabólica mitocondrial y Ψm en miocitos cardíacos aislados de ratones wt de 10 a 15 semanas de edad, en respuesta a la activación de LTCC usando el agonista de canal BayK(-). La actividad metabólica depende del consumo de oxígeno y del transporte de electrones mitocondriales a lo largo de la cadena de transporte de electrones. Por lo tanto, medimos las alteraciones en el transporte de electrones mitocondriales en miocitos cardíacos intactos colocados en hidrogeles blandos y rígidos durante al menos 3 h, al monitorear los cambios en la oxidación de flavoproteínas (como autofluorescencia). Descubrimos que los miocitos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos mostraron un aumento significativo en la oxidación de flavoproteínas después de la exposición a BayK(-) frente al enantiómero (+) de BayK que no actúa como agonista (BayK(+)) (Fig. 2a–c). Sin embargo, la magnitud de la respuesta BayK(-) fue significativamente mayor en los hidrogeles rígidos que en los blandos. Es importante destacar que todas las respuestas inducidas por BayK (-) podrían atenuarse con la aplicación del antagonista de LTCC nisoldipino, lo que confirma que el LTCC media la respuesta. Estos datos indican que las alteraciones en la rigidez de la ECM son suficientes para alterar la regulación de la función mitocondrial por parte del LTCC.

Fluorescencia ratiométrica representativa de flavoproteína (a, b) y JC-1 (e, f) registrada a partir de miocitos cardíacos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos antes y después de la exposición a 10 μM BayK(+), o 10 μM BayK(-) en el ausencia o presencia de nisoldipina (15 μM, Nisol). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones sin calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de fármacos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteína para aumentar la oxidación de flavoproteína. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c) y JC-1 (d) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. d–h, fluorescencia de flavoproteína (d) y JC-1 (h) para miocitos cardíacos (n, en suspensión) aislados de ratones cardiomiopáticos cTnI-G203S y contrapartes wt después de la exposición a BayK(+) o 10 μM BayK(−)17 . Toda la significación estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis, o la prueba ANOVA de Browne-Forsythe y Welch (i).

Para examinar el efecto de la rigidez del sustrato en la comunicación estructural-funcional entre el canal y las mitocondrias, también evaluamos las alteraciones en Ψm en condiciones sin calcio. Aunque la fosforilación oxidativa es un proceso dependiente del calcio, Ψm permanece altamente polarizado en condiciones de calcio intracelular bajo (0–535 nM)32,33. De hecho, los estudios realizados en miocitos cardíacos de ratón y cobayo demuestran que la activación del LTCC por tensión de sujeción de la membrana plasmática, la aplicación de una solución con alto contenido de K+ o BayK(−), da como resultado un aumento de Ψm, incluso en ausencia de calcio9 . La despolimerización de actina o β-tubulina con Latrunculin A o colchicina, o la ausencia de distrofina, atenúa el Ψm elevado, lo que indica que la respuesta depende de una arquitectura citoesquelética intacta6,7,9,16. Aquí, de acuerdo con las alteraciones observadas en la oxidación de flavoproteínas, encontramos que los miocitos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos, incubados durante al menos 3 h en HBS sin calcio y con EGTA, ambos mostraron un aumento significativo en Ψm después de la aplicación de BayK(− ) versus BayK(+) (Fig. 2e-g). Una vez más, la magnitud de la respuesta BayK(-) fue significativamente mayor en los hidrogeles rígidos que en los blandos. Todas las respuestas inducidas por BayK(–) se abolieron con nisoldipino, lo que confirma que el LTCC mediaba en la respuesta. Estos datos indican que las alteraciones en la rigidez de la MEC son suficientes para alterar la comunicación estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias.

Significativamente, las alteraciones en la actividad metabólica y Ψm observadas en miocitos wt sembrados en hidrogeles rígidos versus blandos imitaron los datos previos obtenidos de cTnI-G203S versus miocitos cardíacos wt (Fig. 2d, h)6,17. Estos datos indican que el aumento de la rigidez de la MEC puede contribuir a la progresión de la fisiopatología de la MCH.

Examinamos varios sitios "enlazadores" entre el LTCC y las mitocondrias como posibles mediadores de la función mitocondrial en respuesta al aumento de la rigidez del sustrato. Descubrimos que los aumentos inducidos por BayK(-) tanto en la oxidación de flavoproteínas como en Ψm se atenuaron significativamente en miocitos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos en presencia de un péptido derivado específicamente contra el LTCC AID cardíaco que inmoviliza la subunidad β2 de LTCC (AID-TAT péptido, Fig. 1a) (Fig. 3a-f). Se observaron resultados similares en presencia de un péptido que se dirige al sitio de interacción entre la subunidad β2 de LTCC y AHNAK (AHNAK-P4N-TAT, Fig. 1a) (Fig. 3a-f). De manera similar, las alteraciones inducidas por BayK (-) tanto en la oxidación de flavoproteínas como en Ψm se abolieron en presencia de agentes despolimerizantes de actina o β-tubulina Latrunculin A o colchicina respectivamente (Fig. 3g-l). Estos datos confirman una red estructural-funcional clave entre el LTCC cardíaco y las mitocondrias a través de la red del citoesqueleto que regula la función mitocondrial en condiciones de rigidez alterada de la MEC.

Flavoproteína ratiométrica representativa (a, b y g, h) y fluorescencia JC-1 (d, e y j, k) registrada de miocitos cardíacos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos antes y después de la exposición a 10 μM BayK(+), o 10 μM BayK(-) en ausencia o presencia de AID-TAT (10 μM), AHNAK-P4N-TAT (1 μM), Latrunculin A (Latrunc, 5 μM, 20 min de preincubación) o Colchicina (Colch, 1 μM, 3 h de preincubación51). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones sin calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de fármacos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteína para aumentar la oxidación de flavoproteína. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c e i) y JC-1 (f y l) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Toda la significación estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis.

Además de un vínculo intracelular entre el LTCC y las mitocondrias a través de la red del citoesqueleto, también parece existir una asociación estructural-funcional entre la ECM y la actina F a través de la integrina. Curiosamente, aquí encontramos que las alteraciones inducidas por BayK (-) tanto en la oxidación de flavoproteínas como en Ψm se atenuaron significativamente en miocitos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos en presencia de un anticuerpo bloqueador de la función de la integrina β1 murina (CD-29, Fig. 1a ) (Fig. 4a–f). En general, estos datos sugieren que el LTCC cardíaco y la integrina pueden participar como socios en la mediación de la función mitocondrial en condiciones de rigidez de la MEC que imitan el fenotipo saludable y el de la MCH. Exploramos más a fondo esta red mediante la manipulación de la rigidez intracelular. Encontramos que la exposición de miocitos wt colocados en hidrogeles blandos y rígidos a jasplakinolide, un fármaco que estabiliza la actina F y, por lo tanto, endurece la red del citoesqueleto34, fue suficiente para inducir un aumento significativo en la oxidación de flavoproteínas y Ψm (Fig. 4g-l), lo que indica un papel potencial de la rigidez del citoesqueleto en la regulación de la función mitocondrial en ambas condiciones. Estos hallazgos están respaldados por estudios que demuestran que las alteraciones en las proteínas del citoesqueleto son suficientes para influir en la función mitocondrial13,14,15.

Fluorescencia radiométrica representativa de flavoproteína (a, b y g, h) y JC-1 (d, e y j, k) registrada en miocitos cardíacos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos antes y después de la exposición a 10 μM BayK(+), Jasplakinolide (Jasp, 1 μM, 20 min de preincubación), o 10 μM de BayK(-) en ausencia o presencia de CD-29 (5 μg/ml, 30 min de preincubación). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones sin calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de fármacos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteína para aumentar la oxidación de flavoproteína. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c e i) y JC-1 (f y l) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Toda la significación estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis.

Exploramos la reversibilidad del estado mitocondrial hipermetabólico de cTnI-G203S que surge de la mutación de cTnI Gly203Ser, al probar el efecto de reducir la rigidez del sustrato en Ψm y la actividad metabólica mitocondrial en miocitos cardíacos aislados de ratones cTnI-G203S con MCH establecida. Los ratones cTnI-G203S exhiben características distintivas de la MCH, que incluyen hipertrofia e hipercontractilidad a partir de las 21 semanas de edad5,6,17,35. Por lo tanto, los miocitos cardíacos cTnI-G203S de 30 a 50 semanas de edad y los miocitos cardíacos wt de la misma edad se sembraron en hidrogeles rígidos y blandos durante al menos 3 h para imitar la HCM innata y las condiciones saludables, respectivamente. Luego se evaluaron las alteraciones en la rigidez celular y la función mitocondrial. De acuerdo con los datos recopilados de miocitos cardíacos de 10 a 15 semanas de edad, los miocitos de 30 a 50 semanas de edad sembrados en hidrogeles rígidos mostraron un aumento significativo en la rigidez a la compresión en comparación con los hidrogeles blandos (p <0.05, Fig. 5a). Además, los miocitos cTnI-G203S de 30 a 50 semanas de edad sembrados en hidrogeles blandos mostraron una disminución significativa en la rigidez a la compresión en comparación con los sembrados en hidrogeles rígidos (p < 0,05, Fig. 5a). Estos datos demuestran que la rigidez compresiva de los miocitos cardíacos wt puede manipularse para imitar la de los miocitos cTnI-G203S y viceversa. De acuerdo con el fenotipo de HCM, se observaron respuestas exageradas en miocitos cTnI-G203S versus wt cuando se colocaron en placas en condiciones blandas o rígidas (Fig. 5a). Si bien no se observó ninguna alteración en la expresión de lámina A o vinculina, la siembra en placas de miocitos cTnI-G203S en hidrogeles blandos resultó en una disminución significativa en la expresión de integrina β1 (Fig. 5b-g), lo que implica que la integrina es una proteína mecanosensora clave en los miocitos cTnI-G203S .

a Rigidez compresiva (en kPa) de miocitos cardíacos aislados de ratones cardiomiopáticos cTnI-G203S y homólogos wt sembrados en hidrogeles blandos y rígidos, incluida la media ± SEM. b–g Imágenes representativas y puntos de datos cuantificados para miocitos cardíacos cTnI-G203S sembrados en hidrogeles rígidos y blandos teñidos para lamina A (b, c), vinculina (d, e) e integrina (f, g), incluida la media ± SEM . n = número de células, N = número de geles. Toda la significación estadística determinada por las pruebas de Mann Whitney, o por la prueba de Kruskal-Wallis (a).

También medimos alteraciones en la actividad metabólica mitocondrial y Ψm en miocitos cardíacos aislados de ratones cTnI-G203S de 30 a 50 semanas de edad sembrados en hidrogeles rígidos y blandos, en respuesta a la activación del LTCC usando BayK(-). Descubrimos que los miocitos cTnI-G203S colocados en hidrogeles rígidos y blandos mostraron un aumento significativo en la oxidación de flavoproteínas y Ψm después de la exposición a BayK (-) versus BayK (+) (Fig. 6a-f). La magnitud de la respuesta de BayK(-) se redujo significativamente en hidrogeles blandos frente a rígidos, lo que indica que la rigidez de la ECM desempeña un papel fundamental en la regulación de las alteraciones de la función mitocondrial en la fisiopatología de cTnI-G203S. Todas las respuestas inducidas por BayK (-) podrían atenuarse con la aplicación de nisoldipina o AID-TAT (Fig. 6a-f), lo que confirma que una comunicación estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias media la respuesta. Además de esto, las alteraciones inducidas por BayK(-) en la oxidación de flavoproteínas y Ψm se atenuaron significativamente en presencia de CD-29, mientras que la aplicación de jasplakinolida sola fue suficiente para inducir aumentos significativos en la oxidación de flavoproteínas y Ψm (Fig. 6g-l) . Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el LTCC cardíaco y la integrina pueden participar como socios en la mediación del estado mitocondrial hipermetabólico exhibido por los miocitos cTnI-G203S.

Flavoproteína ratiométrica representativa (a, b y g, h) y JC-1 (d, e y j, k) miocitos cardíacos registrados con fluorescencia aislados de ratones cardiomiopáticos cTnI-G203S sembrados en hidrogeles rígidos y blandos antes y después de la exposición a BayK 10 μM (+), Jasplakinolide (Jasp, 1 μM, preincubación de 20 min), o BayK(-) 10 μM en ausencia o presencia de nisoldipino (15 μM, Nisol), AID-TAT (10 μM) o CD- 29 (5 µg/ml, 30 min de preincubación). Los estudios de JC-1 se realizaron en condiciones sin calcio (0 mM de calcio). Las flechas indican la adición de fármacos. Para confirmar que las señales eran de origen mitocondrial, se aplicó FCCP (50 μM) al final de cada experimento de flavoproteína para aumentar la oxidación de flavoproteína. Se aplicó NaCN (40 mM) al final de cada experimento JC-1 para colapsar Ψm. Fluorescencia general de flavoproteína (c e i) y JC-1 (f y l) para todos los miocitos (n) expuestos a fármacos como se indica, incluida la media ± SEM. Toda la significación estadística determinada por las pruebas de Kruskal-Wallis.

Para investigar más a fondo el papel de la integrina LTCC y β1 en la progresión de la enfermedad, evaluamos los niveles de expresión de la integrina LTCC y β1 en un homogeneizado de corazón completo obtenido de ratones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos. No encontramos diferencias significativas en la expresión de LTCC en corazones cTnI-G203S precardiomiopáticos y poscardiomiopáticos o corazones wt de la misma edad (Fig. 7a, b y Fig. 2 complementaria). Sin embargo, se observaron alteraciones en la expresión de la integrina β1 en corazones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos versus wt, y los aumentos más sustanciales ocurrieron en corazones poscardiomiopáticos (Fig. 7c, d y Fig. 2 complementaria). En general, las alteraciones en la expresión de la integrina parecen "empeorar" tarde en la progresión de la enfermedad de MCH cTnI-G203S. Esto puede ser indicativo de un estado de mala adaptación36.

Análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína del canal de calcio tipo L (a, b) y de la integrina β1 (c, d) realizado en homogeneizado de corazón total agrupado de grupos de 5 pre- (10-15 semanas de edad) o post-cardiomiopáticos (30 –50 semanas de edad) ratones cTnI-G203S y homólogos wt de la misma edad. Inmunotransferencias representativas sondeadas con subunidad α1C del canal de calcio tipo L (CaV1.2, a) o anticuerpo de integrina β1 (c), luego anticuerpo monoclonal GAPDH. Análisis de densitometría de la expresión de la proteína CaV1.2 (b) o integrina β1 (d), normalizada a la expresión de GAPDH asociada. n = número de repeticiones técnicas. Un ANOVA de Browne-Forsythe y Welch (b) o una prueba de Kruskal-Wallis (d) determinó la significación estadística. Análisis de densitometría de la expresión relativa de mTOR (calculada como Phospho-mTOR/Total mTOR) realizado en fracciones citoplásmicas (e) y nucleares (f) agrupadas de grupos de cinco ratones cTnI-G203S pre o poscardiomiopáticos y contrapartes wt de la misma edad. Se usaron anticuerpos β-tubulina e histona H2B como controles de carga para las fracciones citoplásmica y nuclear respectivamente. n = número de repeticiones técnicas. Una prueba ANOVA (e) o Kruskal-Wallis (f) de Browne-Forsythe y Welch determinó la significación estadística. g Esquema que indica el vínculo estructural-funcional entre el canal de calcio tipo L, la red del citoesqueleto, las mitocondrias, la integrina y la matriz extracelular en miocitos cardíacos wt y cTnI-G203S. Una arquitectura citoesquelética alterada en los miocitos cardíacos cTnI-G203S puede desencadenar un mecanismo de retroalimentación desadaptativo entre el aumento de la rigidez de la matriz extracelular y del citoesqueleto, lo que da como resultado un estado mitocondrial hipermetabólico.

El objetivo de rapamicina en mamíferos (mTOR) es una vía de señalización independiente del calcio, que es un regulador clave de la síntesis de proteínas, la biogénesis mitocondrial y el metabolismo celular, y se ha implicado en el desarrollo de HCM37,38,39. Los miocitos aislados de ratones cTnI-G203S muestran un aumento en el tamaño y la densidad de las mitocondrias en comparación con los miocitos wt, pero ninguna alteración en la concentración de calcio intracelular2,3. Por lo tanto, aquí probamos la participación de mTOR en el desarrollo de la miocardiopatía cTnI-G203S. Las alteraciones en la actividad metabólica mitocondrial mediada por LTCC y el estado mitocondrial hipermetabólico resultante ocurren antes del desarrollo de la patología cTnI-G203S6,17. Para determinar si las alteraciones en la expresión de proteínas ocurren temprano o tarde en la progresión de la enfermedad, evaluamos la expresión de mTOR en fracciones citoplásmicas y nucleares preparadas a partir de corazones de ratones cTnI-G203S pre y poscardiomiopáticos. La expresión de mTOR fosforilada (fosfo-mTOR) se normalizó a mTOR total para producir una expresión de mTOR "relativa" (consulte las Figs. 3 y 4 complementarias para obtener información sobre fosfo-mTOR individual y mTOR total). Encontramos que la expresión relativa de mTOR aumentó significativamente en cTnI-G203S post-cardiomiopático versus precardiomiopático y fracciones citoplasmáticas wt (Fig. 7e) y nucleares (Fig. 7f); apoyando la noción de que mTOR puede desempeñar un papel en el proceso de envejecimiento cardíaco 'normal'37. Sin embargo, en particular, la expresión relativa de mTOR se elevó significativamente en las fracciones nucleares de cTnI-G203S antes y después de la cardiomiopatía frente a las contrapartes wt de la misma edad (Fig. 7f). Estos datos sugieren que la activación de mTOR también puede contribuir a la fase temprana de la enfermedad. Sin embargo, se requerirían más estudios funcionales que utilicen las plataformas descritas en este estudio para confirmar un papel causal de mTOR en la progresión de la enfermedad.

Una "interrupción de la comunicación" intracelular entre el LTCC y las mitocondrias contribuye a un estado mitocondrial hipermetabólico que surge de las mutaciones del gen de la cadena pesada de cTnI y β-miosina6,17,31. Estas respuestas preceden al desarrollo de HCM. El aumento de la síntesis de proteínas de la MEC se ha implicado en la progresión de la patología de la MCH humana20,21,22. Aquí, utilizando una plataforma in vitro que imita la rigidez del miocardio HCM, demostramos que las alteraciones en la rigidez del sustrato pueden modular la comunicación estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias. Esto parece ocurrir a través de sitios "enlazadores" clave dentro de la red del citoesqueleto, tanto en condiciones sanas como de MCH (Figs. 2 y 6). Con esto, proponemos que el aumento de la rigidez de la ECM, aguas arriba del LTCC, puede contribuir a la progresión de la fisiopatología de la MCH como resultado de la mutación del gen Gly203Ser. En apoyo de esto, los tejidos cardíacos creados mediante la siembra de miocitos cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos sanos en tiras de miocardio descelularizado extraído de un modelo porcino de MCH muestran una mayor rigidez21.

Encontramos que la inhibición de la proteína mecanosensora β1-integrina abolió las alteraciones inducidas por LTCC en la actividad metabólica mitocondrial, mientras que el aumento de la rigidez del citoesqueleto simuló alteraciones inducidas por LTCC en la función mitocondrial (Figs. 4 y 6). Curiosamente, el LTCC cardíaco y la integrina β1 son proteínas transmembrana que se asocian estructural y funcionalmente con la actina F12,23,25,26. Existe buena evidencia de que la mecanotransducción cardíaca ocurre tanto de adentro hacia afuera como de afuera hacia adentro40,41. Con esto, proponemos un mecanismo de retroalimentación entre la ECM y la red del citoesqueleto, a través de la integrina, que ayuda a regular las alteraciones en la función mitocondrial mediada por LTCC en condiciones saludables, pero se vuelve desadaptativo en respuesta a la mutación del gen sarcomérico Gly203Ser, participando así en la progresión de la Estado de enfermedad de la MCH (Fig. 7g). Para evaluar el efecto de las alteraciones en la rigidez del sustrato sobre la regulación de la función mitocondrial por parte del LTCC en condiciones sanas y de HCM, todos los estudios de este artículo se realizaron en miocitos cardíacos inactivos. Además, para explorar el papel regulador metabólico del vínculo estructural-funcional entre el LTCC y las mitocondrias, se realizaron alteraciones en Ψm en condiciones sin calcio. Se requerirían estudios futuros que involucren mediciones de la contractilidad para aclarar aún más el papel de la rigidez de la MEC en los mecanismos identificados en este estudio.

Los estudios genéticos han identificado más de 1500 mutaciones genéticas de sarcómero diferentes asociadas con el desarrollo de HCM4. Una revisión de los estudios que investigan la fisiopatología de la MCH reveló que, si bien existen algunas similitudes, cada mutación parece conducir a una fisiopatología específica de la mutación42. Por lo tanto, sería necesaria una mayor investigación para confirmar la participación del mecanismo propuesto en el desarrollo de mutaciones específicas del gen sarcomérico que causan la MCH. Desde una perspectiva terapéutica, el tratamiento de ratones cTnI-G203S con AID-TAT restaura la cinética de LTCC, la actividad metabólica mitocondrial y previene el desarrollo de hipertrofia17. Otros estudios que involucran el análisis proteómico del tejido cardíaco de pacientes con MCH con mutaciones genéticas sarcoméricas identificadas sugieren la red de microtúbulos como un posible objetivo de tratamiento43. Estos hallazgos respaldan la idea de que enfocarse en las respuestas celulares posteriores a la rigidez de la MEC puede ser una consideración importante en el desarrollo de terapias preventivas44. Con una mayor caracterización, los sitios de enlace clave entre el LTCC y las mitocondrias y/o las proteínas sarcoméricas modificadoras pueden representar objetivos terapéuticos potenciales para el desarrollo de enfoques de tratamiento de la MCH para pacientes con mutaciones genéticas sarcoméricas identificadas.

Los hidrogeles de poliacrilamida (PA) se fabricaron sobre la base de un método descrito anteriormente45. Se fabricaron soluciones de prepolímeros para hidrogeles que imitan el miocardio sano (blando) y HCM (rígido) mediante la combinación de acrilamida (Bio-Rad), bis-acrilamida (Bio-Rad), PBS de Dulbecco (libre de Mg2+ y Ca2+) (Life Technologies) y H2O desionizada (consulte la tabla 1 para ver la receta). Los cubreobjetos se limpiaron y activaron en un limpiador de ozono durante 1 min por cada lado (Bioforce Nanosciences UV/Ozone ProCleaner), luego se funcionalizaron durante 5 min en una solución que contenía metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo (0,5 % V/V) (Merck) , ácido acético glacial (3% v/v) y etanol puro (96,5% v/v). Los cubreobjetos funcionalizados se enjuagaron en etanol durante 1 min y se dejaron secar al aire, luego se recubrieron con dimetildiclorosilano (DCDMS) para crear una superficie plana no adhesiva para fabricar hidrogeles. Luego se preparó una solución de polímero agregando 10 µl de persulfato de amonio (APS) (Bio-Rad) y 1 µl de N,N,N′,N′- tetrametiletilendiamina (TEMED) (Bio-Rad) a 1 ml de pre- solución de polímero A continuación, se pipetearon 4 o 12 µl de solución de polímero en portaobjetos de vidrio recubiertos de DCDMS para lograr una altura final de 50 µm (para cubreobjetos redondos de 10 mm de diámetro o cuadrados de 15 × 15 mm2, respectivamente). Luego se colocaron suavemente cubreobjetos funcionalizados en la parte superior. Se permitió que los hidrogeles se polimerizaran durante 20 minutos antes de retirar los cubreobjetos de los portaobjetos recubiertos con DCDMS y esterilizarlos con UV.

Los hidrogeles se enjuagaron tres veces en tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) (50 mM, pH 8,5) (Life Technologies), luego se sumergieron en N-sulfosuccinimidil-6-(4′-azido-2 hexanoato de ′-nitrofenilamino) (sulfo-SANPAH; Thermo Scientific) en HEPES (1 mg/ml). Sulfo-SANPAH se activó bajo luz ultravioleta (365 nm, 10 min), luego se eliminó y los hidrogeles se enjuagaron en HEPES. A continuación, los hidrogeles se sumergieron en laminina de ratón (ThermoFisher 23017015) en HEPES (25 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Antes de su uso, los hidrogeles se enjuagaron con PBS para eliminar la laminina no unida.

Se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM) para medir la rigidez compresiva de hidrogeles y células individuales, medida en módulos de Young. Las mediciones se realizaron con un microscopio de fuerza atómica MFP-3D (Asylum Research), utilizando voladizos de nitruro de pirex recubiertos de cromo/oro de 200 µm con puntas triangulares (Nano World modelo PNP-TR). Las mediciones se realizaron en PBS 1x (sin Mg2+ ni Ca2+) y se palparon con indentaciones de 2 nN (velocidad de aproximación: 2 µm/s, velocidad de retracción: 10 µm/s). La porción lineal de la curva de fuerza generada por contacto se usó para determinar el módulo de Young a través de un código personalizado en Igor Pro, como se describió anteriormente46. Las muescas se hicieron por triplicado para asegurar la estabilidad de las medidas y se promediaron para dar una rigidez promedio por muesca. Se eligieron al azar seis puntos a través de cada hidrogel para sangrar. El promedio de estas seis muescas se utilizó como una estimación de la rigidez a la compresión general del hidrogel47. Se caracterizaron dos repeticiones técnicas por repetición biológica para garantizar que los hidrogeles tuvieran una rigidez uniforme. La rigidez de las celdas se caracterizó sangrando el centro de las celdas individuales. Se sangraron aproximadamente 28 células por repetición biológica27,48. Para la rigidez de una sola célula, se realizaron cuatro repeticiones técnicas por repetición biológica. Se realizaron un mínimo de cuatro repeticiones biológicas por condición.

La línea celular de mioblastos H9C2, aislada de tejido ventricular de rata, fue suministrada por la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Salisbury, Reino Unido) y adquirida de CellBank Australia (Westmead, NSW, número de catálogo 88092904). Las células H9C2 se cultivaron según las instrucciones de ECACC. Las células se resucitaron en medio de crecimiento completo compuesto por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, glucosa alta, piruvato, ThermoFisher), complementado con glutamina 4 mM y suero de ternero fetal al 10%. Las células se sembraron a razón de 1–3 × 10 000 células/cm2. Los cambios de medio se realizaron una vez cada 2-3 días. El subcultivo se realizó a ~70-80% de confluencia. Para subcultivar o sembrar en hidrogeles de PA, se retiró y desechó DMEM, se reemplazó con tripsina-EDTA al 0,25 % (ThermoFisher) y se incubó durante ~3 min (37 °C) antes de centrifugar la suspensión celular a 1200 rpm (5 min). A continuación, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en medio de crecimiento completo precalentado. Para los hidrogeles de PA, las células se colocaron en placas a 10 000 células por hidrogel (suave o rígido) y se incubaron durante 24–48 h a 37 °C antes de la experimentación.

Se usaron ratones macho para todos los estudios. Se usaron miocitos cardíacos adultos aislados de ratones que expresan el gen cTnI humano que codifica la mutación cTnI-G203S que causa la MCH humana. Los ratones desarrollan características distintivas de la MCH a las 21 semanas5,6,17,35. Se utilizaron ratones cTnI-G203S de 10 a 15 semanas de edad (precardiomiopáticos) y de 30 a 50 semanas de edad (postcardiomiopáticos) para estudios in vitro y ex vivo. Se usaron ratones de la misma edad que expresaban el gen cTnI humano normal como controles (wt). Se usaron ratones macho para eliminar posibles diferencias en las respuestas debidas al sexo. Los experimentos se realizaron en un total de setenta y cuatro ratones wt de 10–15 semanas de edad, diez ratones cTnI-G203S de 10–15 semanas de edad, dieciséis ratones wt de 30–50 semanas de edad y cuarenta y cinco ratones de 30– Ratones cTnI-G203S de 50 semanas de edad. Todos los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Australia Occidental de acuerdo con el Código de prácticas australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos (NHMRC, 8.ª edición, 2013).

Se aislaron miocitos cardíacos adultos de ratones wt y cTnI-G203S como se describió previamente16,17,49. Los ratones se anestesiaron con pentobarbitona sódica (240 mg/kg, mediante inyección intraperitoneal), luego se extirparon los corazones y se canularon en un aparato Langendorff a través de la aorta. Los corazones se perfundieron con tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contenía (en mM): 120 NaCl, 25 NaHCO3, 4,8 KCl, 2,2 MgSO4, 1,2 NaH2PO4 y 11 glucosa (pH = 7,35 con O2/CO2 a 37 °C) para: 4 min a 37 °C, luego 3 min en presencia de 2,4 mg/ml de colagenasa B, luego 8 min en presencia de calcio 40 µM. Después de la perfusión, se separó el tejido ventricular y se trituró para disociar los miocitos en suspensión. La suspensión de miocitos se dejó reposar durante 20 min, se descartó el sobrenadante y los miocitos se resuspendieron en solución tamponada con Hepes (HBS) libre de calcio que contenía (en mM): 5,3 KCl, 0,4 MgSO4·7H2O, 139 NaCl, 5,6 Na2HPO4·2H2O, 5 glucosa , 20 Hepes y 2 glutamina (pH = 7,4 a 37 °C) en presencia o ausencia de EGTA 3 mM (para experimentos con calcio 0 mM). Para los experimentos que contenían calcio, el calcio se tituló hacia atrás para lograr una concentración extracelular final de 1,8 mM. Las suspensiones de miocitos se sembraron en hidrogeles y se incubaron durante al menos 3 horas a 37 °C antes de la experimentación. Todos los estudios in vitro se realizaron en miocitos inactivos recién aislados a 37 °C.

Las células se prepararon para imágenes confocales basadas en métodos descritos anteriormente7,16. Después de la siembra y la incubación, las células H9C2 o los miocitos cardíacos adultos se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), que contenía en mM: 13 KCl, 7,35 KH2PO4, 0,69 NaCl, 40,4 y 40,4 Na2HPO4 · 7H2O (pH = 7,4), luego se fijaron con paraformaldehído al 4% (PFA, en PBS, durante 15 min), y se permeabilizó con Triton X-100 al 0,3% (15 min). Después de la permeabilización, las células se incubaron en una solución de bloqueo que contenía suero de cabra al 5 % y suero de caballo al 5 % (en PBS) durante 1 hora a 37 °C. A continuación, las células se incubaron con anticuerpos primarios lamina A (1:400, Abcam, ab26300) y vinculina (1:200, Abcam, ab130007) en BSA al 5 % (en PBS, 1 h a 37 °C). Luego, las células se incubaron con rodamina faloidina (TRITC, 1:400, ThermoFisher, R415), Goat F(ab) Anti-Rabbit IgG H&L (FITC, 1:200, Abcam ab7050) y Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor®). 647, 1:200, Abcam ab150115) en BSA al 5 % (en PBS, 1 h a 37 °C). Como alternativa, las células se incubaron con un anticuerpo primario de integrina β1 (1:100, ThermoFisher MA1-06906) en BSA al 5 % (en PBS, 1 h a 37 °C), seguido de Goat anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® Plus 488, 1:400, ThermoFisher A32723) en BSA al 5 % (en PBS, 1 h a 37 °C). Finalmente, las células se incubaron con tinción de ácido nucleico DAPI (1:200 en PBS, Sigma-Aldrich D9542) durante 10 min a temperatura ambiente antes de montarlas en portaobjetos de vidrio para obtener imágenes. Se tomaron imágenes de las células en un microscopio fluorescente invertido Olympus IX71 con un aumento de 60x.

El yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbencimidazolilcarbocianina (JC-1) se adquirió de Molecular Probes (Eugene, Oregón, EE. UU.). Se compraron cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), colchicina, latrunculina A, nisoldipina, (S)-(-)-Bay K8644 (BayK(-)) y cianuro de sodio (NaCN) de Merck (Kenilworth, New Jersey, Estados Unidos). Jasplakinolide se adquirió de Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, EE. UU.); (R)-(+)-Bay K8644 (BayK(+)) de BioVision (Milpitas, California, EE. UU.); y CD-29 de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.). El péptido AID-TAT se sintetizó utilizando la secuencia de aminoácidos QQLEEDLKGYLDWITQAE, incluida una secuencia TAT de penetración celular (RKKRRQRRR) unida mediante ácido 6-aminohexanoico (AusPep, Tullamarine, Victoria, AUS)50. El péptido AHNAK-P4N-TAT se sintetizó usando la secuencia de aminoácidos KGKHGKLKFGTFGGLGSKSKGHYEVT unida a la secuencia TAT como se describió previamente (Mimotopes Pty Ltd, Victoria, AUS).

El potencial de membrana mitocondrial (Ψm) se evaluó mediante el indicador fluorescente JC-1 (200 nM, período de incubación = 3 h, ex = 480 nm, em = 580/535 nm, intervalo = 2 min, exposición = 50 ms)16,17. Al final de cada experimento, se aplicó cianuro de sodio bloqueador del transporte de electrones mitocondriales para colapsar Ψm, lo que confirma que la señal de JC-1 era indicativa de Ψm (NaCN, 40 mM). La oxidación de flavoproteínas mitocondriales se evaluó mediante el registro de la autofluorescencia de los miocitos como se describió anteriormente (ex = 480 nm, em = 535 nm, intervalo = 1 min, exposición = 250 ms)16,17. Se añadió el desacoplador de la cadena de transporte de electrones mitocondrial FCCP (50 μM) al final de cada experimento para aumentar la oxidación de flavoproteínas, lo que confirma que la señal era de origen mitocondrial. Toda la fluorescencia in vitro se midió en una cámara Andor Zyla SCMOS de 5,5 MP acoplada a un microscopio invertido Nikon TE2000-U. Las imágenes radiométricas de JC-1 o fluorescencia de flavoproteínas se cuantificaron utilizando Metamorph 7.10. Las regiones que contenían miocitos se rastrearon manualmente para obtener una señal fluorescente para cada célula. Se usó como fondo una región equivalente que no contenía células y se restó para cada célula. Las respuestas a los tratamientos se informaron como un porcentaje de aumento o disminución del promedio previo al tratamiento (basal).

La concentración de proteína de todas las muestras se cuantificó usando el ensayo de proteína de Bradford usando BSA como estándar. Se cargaron 25 µg de muestras en gel prefabricado de poliacrilamida SDS Mini-PROTEAN® TGX Stain-FreeTM SDS al 10 % (Bio-RAD Laboratories), luego se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm (Trans-Blot® TurboTM Transfer Pack, Bio- RAD Laboratories) usando el Bio-RAD Trans-Blot® TurboTM Transfer System. Las transferencias se eliminaron entre cada paso de re-sondeo utilizando tampón de eliminación, que constaba de (en mM): Tris HCl pH 6,8: 62,5, 2-mercaptoetanol: 100, SDS al 2 %, 30 min a 50 °C). La densitometría cuantitativa se realizó en imágenes capturadas utilizando un sistema de imágenes Chemidoc (Bio-rad) y el software ImageJ. Los datos se presentan como densidad óptica de la expresión de proteínas, normalizados al control de carga detectado en la misma transferencia.

El análisis de inmunotransferencia se realizó en homogeneizado de corazón total agrupado de grupos de cinco ratones wt y cTnI-G203S de 10 a 15 semanas de edad y de 30 a 50 semanas de edad. Brevemente, se pesaron corazones congelados instantáneamente, se trituraron hasta obtener un polvo fino en N2 líquido utilizando un mortero y una maja, y se homogeneizaron en tampón RIPA 1:4 que constaba de (en mM): NaCl 150, Tris 50, Na4P2O7 20, Na3VO4 2, NaF 1, desoxicolato de sodio al 0,5 %, Triton X-100 al 1 %, SDS al 0,1 %, pH 7,4, complementado con cOmplete™, Mini, proteasa sin EDTA (Roche, 4693159001) y fosfatasa PhosStopTM (Roche, 4906837001, dilución 1:100 ) comprimidos inhibidores. A continuación, el homogeneizado de corazón total se centrifugó a 10 000 g durante 5 min a 4 °C. Las transferencias se probaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-CaV1.2 policlonal de conejo (Alomone, ACC-003, 1:200) o integrina anti-β1 monoclonal de conejo (D6S1W) (Cell Signaling Technology 34971, 1:1000). Se usó anti-GAPDH monoclonal de conejo (Cell Signaling Technology, 2118, 1:1000) como control de carga. A continuación, las transferencias se sondaron con anticuerpo secundario policlonal anti-IgG de conejo H&L (HRP) preabsorbido (Abcam, ab97080, 1:10.000).

Las fracciones subcelulares se prepararon a partir de grupos de cinco corazones wt y cTnI-G203S de 10 a 15 semanas de edad y de 30 a 50 semanas de edad, un kit de extracción nuclear y citoplasmática NE-PERTM (ThermoFisher Scientific, 78833), complementado con cOmplete™ , Mini, comprimidos inhibidores de la fosfatasa PhosStopTM (Roche, 4906837001) y proteasa sin EDTA (Roche, 4693159001), según los protocolos del fabricante. Las transferencias se probaron con los siguientes anticuerpos primarios: mTOR total, mAb de conejo mTOR (7C10) (Cell Signaling Technology, 2983, 1:1000); mTOR activo, fosfo-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb (tecnología de señalización celular, 5536, 1:1000); SRP6 total, proteína ribosómica S6 (5G10) mAb de conejo (Cell Signaling Technology, 2217, 1:1000); SRP6 activo, proteína ribosomal fosfo-S6 (Ser235/236) (2F9) mAb de conejo (Cell Signaling Technology, 4856, 1:1000). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios para cargar los controles: anticuerpo β-tubulina (Cell Signaling Technology, 2146, 1:500); histona H2B (D2H6) mAb de conejo (Cell Signaling Technology, 12364, 1:1000). Las transferencias se probaron con anticuerpo secundario preadsorbido IgG anti-conejo H&L (HRP) de cabra (Abcam, ab97080, 1:10000). Se usaron los mismos anticuerpos para confirmar la pureza de las fracciones citoplasmáticas y nucleares (Fig. 5 complementaria).

Especies: H, M, R; Aplicaciones: WB, ICC, IF, IFC, IHC, IP; Validado por Alomone. Cita: 124 (https://www.alomone.com/p/anti-cav1-2-antibody/ACC-003). Integrina anti-β1 monoclonal de conejo (D6S1W, Cell Signaling Technology, 34971): Especie: H, M, R; Aplicaciones: WB, IHC; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 31 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/integrin-b1-d6s1w-rabbit-mab/34971). Anti-GAPDH monoclonal de conejo (Cell Signaling Technology, 2118): Especies: H, M, R, Mk, B, Pg; Aplicaciones: WB, IHC, IF, F; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 5360 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/gapdh-14c10-rabbit-mab/2118). mTOR total (mTOR) (7C10, mAb de conejo, Cell Signaling Technology, 2983): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IP, IHC, IF, F; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 1837 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/mtor-7c10-rabbit-mab/2983). mTOR activo (fosfo-mTOR) (Ser2448, D9C2, XP® Rabbit mAb, tecnología de señalización celular, 5536): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IP, SI; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 1356 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-mtor-ser2448-d9c2-xp-rabbit-mab/5536). SRP6 total (proteína ribosómica S6, 5G10, mAb de conejo, tecnología de señalización celular, 2217): especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IHC, IF; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 1610 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/s6-ribosomal-protein-5g10-rabbit-mab/2217). SRP6 activo (proteína ribosomal fosfo-S6, Ser235/236, 2F9, mAb de conejo, Tecnología de señalización celular, 4856): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IF, F; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 255 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-s6-ribosomal-protein-ser235-236-2f9-rabbit-mab/4856). Anticuerpo de β-tubulina (Cell Signaling Technology, 2146): Especies: H, M, R, Mk, Z, B; Aplicaciones: WB, IHC, IF, F; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 676 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/b-tubulin-antibody/2146). Histona H2B (D2H6, mAb de conejo, Tecnología de señalización celular, 12364): Especies: H, M, R, Mk; Aplicaciones: WB, IHC, ChiP; Validado por Tecnología de Señalización Celular. Cita: 33 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/histone-h2b-d2h6-rabbit-mab/12364).

Los resultados se informan como media ± SEM. Para los datos no paramétricos, se aceptó la significación estadística a P < 0,05 utilizando la prueba de Mann Whitney (bilateral) o la prueba de Kruskal-Wallis (unidireccional) para comparaciones múltiples. Para los datos paramétricos, se aceptó la significación estadística en P < 0,05 utilizando una prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch (unidireccional) (GraphPad Prism versión 9.1.2). El número de réplicas y las comparaciones estadísticas se especifican en cifras.

Se utilizó el software Power and Sample Size (PS) para determinar el tamaño de la muestra teniendo en cuenta la variabilidad entre animales y la variabilidad intraanimal. Con esto, se determinó que sería necesario estudiar las respuestas en 10 ratones de cada cepa/genotipo de ratón para rechazar la hipótesis nula de que las medias poblacionales de los grupos experimentales son iguales con una probabilidad/potencia de 0,95 (probabilidad de error tipo I = 0,05). Cabe destacar que los valores de p resultantes de todos los datos in vitro oscilaron entre p < 0,0001 y p < 0,0216, lo que indica que los tamaños de muestra utilizados fueron suficientes para superar el nivel de significación establecido.

No se excluyeron datos obtenidos de células vivas. Todos los intentos de replicación en células vivas fueron exitosos. Para los estudios in vitro, los experimentos que involucraron el uso de diferentes agonistas/antagonistas se realizaron en diferentes días experimentales, de forma aleatoria. Además, dos personas realizaron experimentos simultáneamente, en dos configuraciones experimentales fluorescentes diferentes. Un individuo estaba al tanto de los agonistas/antagonistas que se aplicaban para garantizar que los agentes correctos se aplicaran en el orden correcto. El otro individuo estaba cegado. Los datos se replicaron de manera confiable entre individuos en todos los casos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y el archivo de información complementaria). Los datos de origen se pueden obtener en el archivo de datos complementarios.

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Escuela de Ciencias Humanas, Universidad de Australia Occidental, Crawley, WA, Australia

Helena M. Viola, Caitlyn Richworth, Tanya Solomon, Ian L. Chin, Henrietta Cserne Szappanos, Yu Suk Choi y Livia C. Hool

Universidad Nacional de Australia, Canberra, ACT, Australia

Srinivasan Sundararaj, Dmitry Shishmarev y Marco G. Casarotto

Instituto de Investigación Cardiaca Victor Chang, Sydney, NSW, Australia

Livia C. Hool

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Conceptualización: HMV, LH Curación de datos: HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Análisis formal: HMV, ILC, YSC, HCS, SS, DS Investigación: HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Metodología: HMV, YSC Administración de proyectos: HMV Supervisión: HMV, YSC, HCS, MC, LH Validación: HMV, YSC, MC Visualización: HMV Redacción: preparación del borrador original: HMV Redacción: revisión y edición: HMV, CR, TS, ILC , YSC, HCS, SS, DS, MC, LH

Correspondencia a Helena M. Viola o Livia C. Hool.

MC, SS, DS y LH son inventores de la patente presentada (Número de solicitud de Australia 2021900252). Todos los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Viola, HM, Richworth, C., Solomon, T. et al. Un mecanismo de retroalimentación desadaptativo entre la matriz extracelular y el citoesqueleto contribuye a la fisiopatología de la miocardiopatía hipertrófica. Comun Biol 6, 4 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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Recibido: 22 febrero 2022

Aceptado: 17 de noviembre de 2022

Publicado: 03 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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