La eliminación de APOE4 astrocítica confiere protección cerebrovascular a pesar del aumento de la angiopatía amiloide cerebral

Molecular Neurodegeneration volumen 18, Número de artículo: 17 (2023) Citar este artículo

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La enfermedad de Alzheimer (AD) y la angiopatía amiloide cerebral (CAA) se caracterizan por la acumulación de amiloide-β (Aβ) en el cerebro, aunque Aβ se deposita principalmente en el parénquima cerebral en AD y en la vasculatura cerebral en CAA. La presencia de CAA puede exacerbar los resultados clínicos de los pacientes con AD al promover la hemorragia intracerebral espontánea y la isquemia que conducen al deterioro cognitivo asociado con CAA. Genéticamente, AD y CAA comparten el alelo ε4 del gen de la apolipoproteína E (APOE) como el factor de riesgo genético más fuerte. Aunque se han centrado enormes esfuerzos en descubrir el papel de APOE4 en la patogenia de la placa parenquimatosa en la EA, todavía faltan estudios sobre el mecanismo que investiguen el papel de APOE4 en la CAA. Aquí, abordamos si la abolición de APOE4 generada por los astrocitos, los principales productores de APOE, es suficiente para mejorar el daño vascular asociado a CAA y CAA.

Generamos ratones transgénicos que depositaron tanto CAA como placas en las que la expresión de APOE4 puede suprimirse selectivamente en astrocitos. A los 2 meses de edad, un punto de tiempo anterior a la CAA y la formación de placa, se eliminó APOE4 de los astrocitos de ratones knock-in 5XFAD APOE4. Se evaluó a los ratones a los 10 meses de edad para determinar la placa de Aβ y la patología CAA, la gliosis y la integridad vascular.

La reducción de los niveles de APOE4 en los astrocitos cambió el depósito de Aβ fibrilar del parénquima cerebral a la vasculatura cerebral. Sin embargo, a pesar del aumento de CAA, la eliminación de APOE4 astrocítica redujo la gliosis mediada por Aβ en general y también condujo a una mayor integridad y función cerebrovascular en los vasos que contienen CAA.

En un modelo de CAA en ratones, la reducción de APOE4 derivada específicamente de los astrocitos, a pesar del aumento del depósito fibrilar de Aβ en la vasculatura, es suficiente para reducir la gliosis mediada por Aβ y la disfunción cerebrovascular.

La angiopatía amiloide cerebral (CAA) y la enfermedad de Alzheimer (AD) son clínicamente distintas pero comparten características moleculares y genéticas superpuestas. Por ejemplo, el marcador patológico detectable más temprano de ambas enfermedades neurodegenerativas incluye la acumulación de amiloide-β (Aβ). El Aβ se deposita en la vasculatura cerebral como CAA y como placas neuríticas en la EA, aunque la CAA coexiste en el 85-95% de los cerebros post mortem con EA [1]. Las manifestaciones clínicas, sin embargo, son dispares: las formas agregadas hiperfosforiladas de tau están relacionadas con la atrofia cortical que se correlaciona fuertemente con el rendimiento cognitivo en la EA [2, 3], mientras que las hemorragias y la isquemia asociadas con la CAA dan lugar a la disfunción vascular [4]. que acelera el deterioro cognitivo en casos de EA y no EA [5,6,7]. Además de aumentar los riesgos de hemorragias intracerebrales, la toxicidad del Aβ vascular compromete la unidad neurovascular [8] al hacer que las células vasculares no respondan a los eventos fisiológicos [9] y al afectar el drenaje perivascular [10], todo lo cual puede exacerbar la progresión de la DA.

A pesar de los diferentes mecanismos por los cuales CAA y AD exacerban la patología mediada por Aβ, CAA y AD comparten un factor de riesgo genético significativo que aumenta la prevalencia y la gravedad de ambas enfermedades. La apolipoproteína E (APOE) juega un papel crítico en el transporte de lípidos [11], aunque el alelo ε4 del gen APOE es perjudicial tanto para CAA [5, 12,13,14,15] como para AD [16, 17] al mejorar patogénicamente Agregación de Aβ y deterioro de la eliminación de Aβ [18, 19]. Este aclaramiento deteriorado promueve un ciclo de autorrefuerzo que deposita aún más Aβ a lo largo de los vasos y en el parénquima para empeorar la DA y la CAA [10, 20, 21]. Además, APOE es un componente importante tanto en CAA [22] como en placas [22,23,24]. Se requiere APOE para el desarrollo de CAA y es un contribuyente clave para la formación de placa parenquimatosa fibrilar [25, 26]. APOE4 también exhibe efectos dependientes e independientes de Aβ [27] en la vasculatura cerebral al reducir el flujo sanguíneo cerebral [28, 29] y aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​[30,31,32]. Aunque ciertamente existe una relación entre APOE y CAA en la disfunción cerebrovascular, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros.

En el sistema nervioso central (SNC), los astrocitos son los productores predominantes de APOE, aunque la microglía reactiva [33, 34], las neuronas lesionadas [35] y ciertas células murales vasculares [36, 37] también generan APOE. Los astrocitos que expresan APOE4, con o sin lesión por enfermedades como CAA, se someten a una extensa remodelación transcripcional, morfológica y funcional hasta un estado patológico marcado por una pérdida de función fisiológica [38,39,40,41,42,43,44, 45,46]. La eliminación selectiva de APOE4 de los astrocitos restaura los astrocitos y otras células en el SNC a un estado más "homeostático", lo que brinda protección contra la progresión de la enfermedad en modelos de amiloidosis en ratones [47, 48] y tauopatía [49]. Ambos estudios en los que se eliminó el APOE4 astrocítico detectaron una disminución de la microglía reactiva, lo que probablemente se asocie con una disminución general de la inflamación del SNC y, en consecuencia, la promoción de la neuroprotección. Además, el Aβ patógeno o la tau también se redujeron, aunque el CAA estaba en niveles muy bajos o indetectables en estos modelos y, por lo tanto, no se cuantificó. En otro estudio, la eliminación de APOE4 astrocítico en ratones que no eran transgénicos fue suficiente para proporcionar cierta protección BBB [50]. Dada la función crítica de los astrocitos en condiciones basales y los efectos perjudiciales del alelo ε4 de APOE en CAA y la vasculatura cerebral, planteamos la hipótesis de que la reducción de la expresión de APOE4 en astrocitos en un modelo de ratón CAA mejoraría la vascularización dependiente y/o independiente de CAA. daño. Para abordar esta hipótesis, utilizamos ratones transgénicos Aldh1l1-Cre/ERT2 BAC inducibles [51] cruzados con ratones 5XFAD (línea 7031) [52] que expresan APOE4flox/flox humano [53], un modelo con CAA extenso, para eliminar selectivamente la expresión de APOE4 en astrocitos tras la administración de tamoxifeno. Además de determinar si la eliminación de APOE4 de los astrocitos protege la vasculatura cerebral, también exploramos las contribuciones de APOE4 astrocítico en la formación y progresión de CAA.

Todos los estudios con animales realizados cumplieron con los protocolos del comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) aprobados por el Comité de Estudios con Animales de la Universidad de Washington en St. Louis. Los ratones 5XFAD (línea Tg7031), un obsequio de R. Vassar en la Universidad Northwestern [52], se cruzaron durante varias generaciones con ratones APOE4flox/flox [53] para generar ratones 5XFAD APOE4flox/flox. Los ratones Aldh1l1-Cre/ERT2 (Jackson Laboratories, Stock No. 031008) también se cruzaron con ratones APOE4flox/flox durante varias generaciones para generar ratones Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox. Para generar ratones 5XFAD Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox, se cruzaron machos 5XFAD APOE4flox/flox con hembras Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox. Nos referimos a los ratones que portan los genes 5XFAD y Aldh1l1-Cre/ERT2 como "5X+AL+" y a sus compañeros de camada sin el gen Aldh1l1-Cre/ERT2 como "5X+AL-". Los compañeros de camada sin el transgén 5XFAD se designan como ratones "5X-". Todos los ratones se alojaron en un ciclo normal de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a alimentos y agua. No hubo diferencias de sexo entre machos y hembras y el número de ratones utilizados se puede encontrar en las leyendas de las figuras.

El tamoxifeno se preparó fresco todos los meses disolviéndolo en aceite de maíz a 20 mg/mL en un agitador a 37 °C durante al menos 12 h. A los 2 meses de edad, todos los ratones de los grupos experimentales recibieron una inyección diaria de tamoxifeno (200 mg/kg, intraperitoneal) durante cinco días consecutivos. El tratamiento con tamoxifeno indujo la combinación de cre para reducir la expresión de APOE4 en astrocitos.

Los ratones se anestesiaron primero con Fatal-Plus (200 mg/kg, intraperitoneal) y luego se perfundieron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada que contenía heparina al 0,3%. Un hemicerebro se fijó en paraformaldehído (PFA) frío al 4 % durante 24 h y luego se crioprotegió con sacarosa al 30 % a 4 °C para histología. El otro hemisferio se diseccionó en cortezas anterior y posterior y se congeló instantáneamente para análisis bioquímicos y de transcripción de genes.

Los hemicerebros fijados en PFA al 4 % se seccionaron coronalmente en un micrótomo de corte y congelación (Leica) a 30 µm y se almacenaron a –20 °C en una solución crioprotectora (PBS 0,2 M, sacarosa al 15 %, etilenglicol al 33 %).

La tinción inmunofluorescente se realizó como se describió anteriormente [54]. Brevemente, dos cerebros Sectas. (180 µm aparte) se permeabilizaron primero en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía Triton-X100 al 0,25 % (TBS-X) y luego se bloquearon usando suero al 3 % en TBS-X. Los cortes de cerebro se incubaron durante la noche en anticuerpo primario diluido en suero al 1 % en TBS-X a 4 °C. Los anticuerpos primarios incluyen: anticuerpo biotinilado HJ3.4 para Aβ1–13 humano (producido internamente, 2 µg/ml), Aβ40 de conejo (Thermo Fisher, 44,136, 1:500), Aβ42 de conejo (Thermo Fisher, 700,254, 1:500 ), anticuerpo APOE de conejo (señalización celular, #13,366, 1:500), GFAP biotinilado para astrocitos (Sigma-Aldrich, MAB3402B, 1:1000), Iba1 de conejo (Wako, 019–19,741, 1:5000), fibrinógeno de conejo ( Abcam, ab34269, 1:1000), y LAMP1 de rata (Developmental Studies Hybridoma Bank, #1D4B, 1:400). Al día siguiente, las secciones se tiñeron durante 1 h con anticuerpos secundarios (1:1000) contra los anticuerpos primarios. Se usó colorante X34 (Sigma-Aldrich, SML1954, 1:5000) para marcar placas de amiloide y CAA. Para la tinción con X34, las secciones de cerebro flotantes se lavaron (3 X 5 min) y se permeabilizaron en TBS-X durante 30 min. A continuación, los tejidos cerebrales se incubaron con solución de trabajo X34 (X34 se añadió a una dilución 1:5000 a etanol al 40 % en tampón TBS, el pH se ajustó con NaOH a una dilución 1:500). Después de 20 min de incubación, las secciones se destiñeron con tampón de lavado X34 (40 % de etanol en TBS, 3 X 2 min) y luego se lavaron con TBS (3 X 5 min). Si se usaron anticuerpos primarios, las secciones se sometieron a un paso de bloqueo de suero como se mencionó anteriormente. Para la tinción de Aβ40 y Aβ42, las secciones primero se incubaron en ácido fórmico al 88 % antes de la tinción.

Las imágenes de inmunofluorescencia en secciones fijas de tejido cerebral se realizaron a 10X en el lector de imágenes Biotek Cytation 5 (Figs. 2a, f, 4a, f, 5a (paneles izquierdos), 6a), 20X en el Leica Thunder Imager DMi8 (Figs. 3e, m, S3a, S5a), o un objetivo de aceite de 40X en el microscopio confocal Leica Stellaris 5 con una resolución de 1024 × 1024 píxeles (Figs. 4c, h, 5a (paneles de la derecha), S4a). Las imágenes se analizaron en el software Fiji (ImageJ) 1.52v. Para la cobertura del área mediante tinción fluorescente, se estableció un umbral único para todas las imágenes para determinar el porcentaje de cobertura del área en la corteza que recubre el hipocampo. CAA y Aβ vascular se diferenciaron de las placas parenquimatosas en función de la morfología. El CAA en este modelo aparece como un depósito de amiloide en forma de banda transversal sobre estructuras que se ha determinado morfológicamente que son vasos sanguíneos piales o penetrantes. La sección transversal de CAA tiene una apariencia similar a un anillo delgado donde el centro es hueco. Las placas parenquimatosas son generalmente esféricas ya menudo compactas. Para validar que esta evaluación de CAA y placas por morfología era precisa, co-teñimos ratones 5XFAD APOE4flox/flox para X34 y CD31 para células endoteliales. Confirmamos que lo que identificábamos como vasos CAA X34+ eran CD31+ mientras que las placas parenquimatosas X34+ eran CD31−, validando así que podemos distinguir los vasos CAA de las placas parenquimatosas con alta confianza. Para el análisis de colocalización, la colocalización de APOE con microglía o astrocitos se realizó utilizando el operador AND de la calculadora de imágenes incorporada. El porcentaje de colocalización entre los dos canales (APOE y microglia, APOE y astrocitos) se normalizó al área de placa o CAA. El análisis de colocalización de vasos CAA individuales se realizó principalmente en vasos de ~ 20 µm. Para cuantificar el número de astrocitos o microglia que rodean CAA o placas, se tomaron imágenes que contenían solo CAA o placa fibrilar de las regiones corticales que recubren el hipocampo de n = 8-10 ratones por grupo. El número de astrocitos o microglía que rodea a CAA o placa se contó manualmente y se normalizó al CAA o tamaño de placa. Las imágenes que contenían una patología mixta de CAA/placa en las que se depositaron conjuntamente CAA y placas no se usaron porque no se pudieron distinguir los efectos específicos de CAA o placa. Para la cuantificación de LAMP1 alrededor de placas o CAA, determinamos el área porcentual cubierta por LAMP1 alrededor de placas individuales o vasos CAA y normalizamos estos valores al área porcentual cubierta por placas X34+ o CAA, respectivamente. Para este análisis, evaluamos seis vasos o placas CAA por ratón y promediamos estos valores para una réplica biológica. Las imágenes se procesaron y analizaron a ciegas a las condiciones experimentales.

La tinción para los depósitos de hemosiderina se realizó como se describió anteriormente con modificaciones menores [54]. Se incubaron ocho secciones de cerebro separadas 180 µm en ferrocianuro de potasio al 2 % (P3289; Sigma-Aldrich) en ácido clorhídrico al 2 % durante 30 min. Se tomaron imágenes de las secciones del cerebro con un escáner de diapositivas Nanozoomer 2.0-HT con un aumento de 40 ×. Las cuantificaciones del tamaño y el número de microhemorragias se realizaron rastreando manualmente hemosiderina + depósitos utilizando el software NDP.View2. Los análisis y trazados fueron completados por investigadores ciegos al tratamiento.

Las imágenes vasculares en vivo para la función cerebrovascular se realizaron como se describió previamente con modificaciones menores [54]. Para obtener muestras de gases sanguíneos, se canuló una arteria femoral (Nova Biomedical, BioProfile pHOx Analyzer) bajo anestesia con isoflurano (4 % de inducción, 1,5 % de mantenimiento). Se realizó traqueostomía para ventilación mecánica (Harvard Apparatus, MiniVent Ventilator) suplementada con 0,5% de flujo de 100% O2. Para visualizar los vasos leptomeníngeos bajo un microscopio fluorescente, se inyectó retroorbitalmente fluoresceína-dextrano (Life Technologies, D1823, 150 ul a 12,5 mg/ml). El isoflurano es un vasodilatador, por lo tanto, los ratones se desconectaron del isoflurano y en su lugar se anestesiaron con pentobarbital (ip, 1,35 ml/kg de una solución madre de 50 mg/ml para la primera dosis, 0,70 ml/kg para las dosis posteriores) durante las imágenes en vivo. A continuación, se realizó una craneotomía sujetando los ratones a un dispositivo estereotáxico hecho a medida (Instrument Machine Shop en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington) y extrayendo el hueso parietal derecho (4 mm de diámetro). La ventana se bañó con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, en mM: 125 NaCl, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2 y glucosa 25 mM). CAA en vasos piales se marcó con tinte X34. Se tomaron imágenes de las arterias piales usando el sistema de microscopía de video digital Nikon Eclipse 600ME (Nikon Instruments Inc.) a 20 × con lentes de inmersión en agua a 1024 × 1024 píxeles usando el software de imágenes MetaMorph versión 7.10.2 (Molecular Devices). El vasodilatador dependiente de células de músculo liso vascular S-Nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP; Sigma-Aldrich, N3398, 50 μM) se aplicó tópicamente a la ventana durante 5 min. Las imágenes se analizaron con el complemento de software ObjectJ versión 1.04q en Fiji (ImageJ) y se midieron los diámetros de segmentos de vasos de 6–8 ~ 30 µm de longitud. Los datos se calcularon como porcentaje de cambio vasodilatador desde el inicio. Los segmentos de vasos de un vaso se promediaron y analizaron como una réplica biológica individual. Los datos se generaron a partir de 9 vasos en 4 ratones (5X+AL-) y 6 vasos en 3 ratones (5X+AL+), con no más de dos vasos de un ratón.

El protocolo para la extracción de lisados ​​de tejidos y la detección de Aβ humano (55) o APOE [49] se describió previamente en detalle. Muestras de tejido cortical de ratón (~ 15 mg) se homogeneizaron secuencialmente con PBS preenfriado y tampón de guanidina 5 M en presencia de inhibidor de proteasa (Roche, 11 697 498 001) e inhibidor de phosSTOP (Roche, 04 906 845 001). Después de agregar perlas magnéticas (Next Advance, ZrOB05) y 20 µl de PBS/1 mg de tejido, el tejido se homogeneizó durante 45 s en un homogeneizador de perlas (Next Advance, Bullet Blender Strom 24) en el ajuste 3. Luego, los homogeneizados se centrifugaron durante 30 min. a 15.000 rpm a 4 °C. El sobrenadante se recogió como la fracción soluble en sal de PBS. A continuación, se añadió el mismo volumen de tampón de guanidina al sedimento y se volvió a homogeneizar en el ajuste 8 durante 3 min. Los homogeneizados se rotaron durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de centrifugación durante 30 min a 15 000 rpm a 4 °C. Finalmente, el sobrenadante se recogió como la fracción soluble en guanidina ("insoluble"). Ambas fracciones se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Los niveles de Aβ40, Aβ42 y APOE en PBS y fracciones de guanidina 5 M se midieron mediante ELISA tipo sándwich y se normalizaron al peso del tejido. Para Aβ40, se utilizó anti-Aβ35-40 HJ2 (interno) como anticuerpo de captura y anti-Aβ13-18 HJ5.1 biotinilado (interno) como anticuerpo de detección. Para Aβ42, anti-Aβ37-42 HJ7.4 (monoclonal de ratón interno) fue el anticuerpo de captura y anti-Aβ13-18 HJ5.1 biotinilado (monoclonal de ratón interno) fue el anticuerpo de detección. El anticuerpo de recubrimiento para la APOE humana era HJ15.3 (monoclonal de ratón interno) y el anticuerpo de captura estaba biotinilado con HJ15.7 (monoclonal de ratón interno) [53].

Se tomaron imágenes de secciones inmunofluorescentes que contenían X34 y GFAP en el microscopio confocal Leica Stellaris 5 (objetivo de aceite de 40 ×, resolución de 1024 × 1024 píxeles). Para este análisis se utilizaron imágenes que contenían exclusivamente CAA o placas fibrilares (sin mezcla de patología de placa/CAA) de regiones corticales que recubren el hipocampo. Se usó Simple Neurite Trace (SNT; herramienta de código abierto del complemento ImageJ) para reconstruir árboles bidimensionales de procesos astrocíticos GFAP+ para generar lecturas morfológicas, incluido el tamaño (casco convexo), el número de procesos, la suma total de la longitud de los procesos, el número de puntos de procesos y longitud media de procesos. Se eligieron al azar de cuatro a cinco astrocitos de dos secciones en cada ratón y no tenían procesos que tocaran otra célula o estuvieran truncados.

El ARN se extrajo de tejido cortical anterior congelado con el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se convirtió en ADNc utilizando el kit de ARN a ADNc según las instrucciones del fabricante. En colaboración con Genome Technology Access Core en la Universidad de Washington, la expresión génica se realizó con el sistema de PCR en tiempo real Fluidigm Biomark HD utilizando cebadores Taqman. La expresión génica relativa se normalizó a Actb.

Se utilizó GraphPad Prism 9.5.0 para los análisis estadísticos. Como se indica en las leyendas de las figuras, los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) para tamaños de grupo inferiores a 10; de lo contrario, los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Ninguna otra comparación estadística fue significativa a menos que se indique lo contrario. La significación estadística entre dos grupos se calculó usando una prueba t de Student para datos no apareados (dos colas). Si los datos tenían varianzas desiguales, se utilizó una prueba t con corrección de Welch.

Para lograr la eliminación específica de astrocitos de APOE4 en un modelo de ratón con patología mixta de CAA y placa, generamos ratones transgénicos 5XFAD (línea 7031) APOE4flox/flox con (5X+AL+) o sin (5X+AL-) el Aldhl1l-Cre gen /ERT2 [51,52,53]. La recombinación mediada por Cre para eliminar la expresión de APOE4 de los astrocitos se logró a través de cinco días consecutivos de tratamiento intraperitoneal (ip) con tamoxifeno en ratones 5X+AL+ o 5X+AL- de 2 meses de edad, un punto de tiempo anterior al desarrollo de placa/CAA (Fig. 1a). El tratamiento con tamoxifeno dio como resultado una reducción sólida del ARNm de APOE4 cortical (Fig. 1b) y la proteína (Fig. 1c, d) en ratones 5X+AL+ de 10 meses de edad. No hubo efecto sexual en el ARNm de APOE4 (Figura S1a) y los niveles de proteína (Figura S1b, c) antes o después de la administración de tamoxifeno.

La recombinación de Cre inducida por tamoxifeno reduce tanto el ARNm como la proteína APOE. a Cronología esquemática del tratamiento con tamoxifeno (5 inyecciones diarias a 200 mg/kg) en 5XFAD (línea 7031) x APOE4flox/flox (5X+AL-) o 5XFAD (línea 7031) x APOE4flox/flox x Aldhl1l- de 2 meses de edad Ratones Cre/ERT2 (5X+AL+), evaluados a los 10 meses de edad. b Expresión relativa de ARNm de APOE normalizado a beta-actina en la corteza. c, d Concentraciones de proteína APOE soluble en PBS y soluble en guanidina-HCL ("insoluble") evaluadas por ELISA de la corteza. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (b), donde se realizó la prueba t de Welch. ∆ = hombres, ○ = mujeres. ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique

Estudios previos han demostrado que APOE4 facilita el desarrollo de CAA, mientras que la deficiencia global de APOE en ratones previene la patología de CAA [25]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la eliminación de APOE4 astrocítico reduciría la carga de placa tanto de CAA como de Aβ en ratones 5X+AL+ de 10 meses de edad. De hecho, detectamos una reducción de los depósitos de Aβ fibrilares totales y de las placas fibrilares (Fig. 2a, b, d), así como la inmunorreactividad de Aβ total (Fig. 2f, g) y las placas de Aβ+ (Fig. 2i) en las regiones corticales suprayacentes. el hipocampo Sin embargo, para nuestra sorpresa, la reducción de APOE4 de los astrocitos resultó en un aumento de Aβ fibrilar en CAA (Fig. 2c, e). Aunque el Aβ vascular se deposita principalmente en forma fibrilar, también hay un componente que es inmunorreactivo a Aβ+ y no fibrilar. Se detectó tinción de Aβ+ en los vasos, pero esta tinción no se vio alterada por la deficiencia de APOE4 astrocítica (Fig. 2h). Sin embargo, la proporción de tinción de Aβ+ en la vasculatura aumentó (Fig. 2j), lo que sugiere una mayor propensión de Aβ a acumularse en los vasos después de la eliminación de APOE4 de los astrocitos. Ciertos modelos de amiloidosis en ratones revelan un efecto del sexo en la acumulación de placas de Aβ, aunque, en nuestro estudio, no observamos ninguna diferencia dependiente del sexo en la cobertura de la carga fibrilar X34+ cortical o la inmunorreactividad de Aβ+ en vasos o placas (Figura S2). Además de la carga amiloide en la corteza, también evaluamos la patología amiloide en una región del cerebro con una carga densa de placa/CAA, el subículo (Figura S3a). Aunque no hubo cambios en el depósito total de placa fibrilar/CAA en el subículo dorsal después de la eliminación de APOE4 astrocítico (Figura S3b), nuevamente observamos un aumento del doble en CAA (Figura S3c) y una disminución del doble en la cobertura de placa (Figura S3d). Estos resultados sugieren que mientras que la ablación embrionaria completa de APOE de todos los tipos de células protege de la progresión de CAA [25], la eliminación selectiva de APOE4 astrocítica en ratones adultos a partir de los 2 meses de edad resultó en CAA exacerbada en 5X+ de 10 meses de edad. ratones AL+.

La eliminación de APOE4 astrocítica antes del depósito de amiloide cambia la distribución de Aβ de las placas a la vasculatura cerebral. a–d, tinción X34 para placas fibrilares/CAA (a) con cobertura de área porcentual de X34 total (b), CAA (c) y placas de amiloide (d) en la corteza que recubre el hipocampo de 5X+ de 10 meses Ratones AL- o 5X+AL+ después de la eliminación de APOE4 astrocitario a los 2 meses de edad. e, Proporción de CAA en la tinción X34+ total. f–i, inmunorreactividad de Aβ (Aβ-IR) (f) con cobertura de área porcentual de Aβ-IR total (g), Aβ-IR vascular (h) y placas (i) en la corteza que recubre el hipocampo. j Proporción de Aβ vascular en Aβ-IR total. Barra de escala: 300 µm. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student no apareada (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (b), donde se realizó la prueba t de Welch. ∆ = hombres, ○ = mujeres. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique

El aumento de CAA después de la eliminación de APOE4 astrocítica nos llevó a preguntarnos si las alteraciones en la composición de Aβ40 versus Aβ42 en el cerebro podrían explicar el cambio en la mayor carga de amiloide vascular. El Aβ40 tiene una mayor propensión a acumularse a lo largo de la vasculatura, aunque los estudios in vivo e in vitro revelan que el Aβ42 es necesario para la siembra inicial del depósito de Aβ vascular [21, 56]. Por lo tanto, un aumento de CAA puede reflejarse en concentraciones más altas de Aβ40 que se han acumulado en la vasculatura. Para abordar esta hipótesis, realizamos ELISA a granel en tejido cortical para Aβ40 y Aβ42 solubles en PBS y solubles en guanidina-HCl 5 M ("insolubles") (Fig. 3a-d). Como era de esperar, detectamos una reducción de Aβ42 insoluble, que es la principal especie de Aβ en las placas (Fig. 3d). Sin embargo, también hubo una disminución en las concentraciones de proteína Aβ40 soluble (Fig. 3a) y Aβ40 insoluble (Fig. 3c) después de la eliminación de APOE4 astrocítica a pesar de CAA elevado por histología (Fig. 2c). Una advertencia es que el ELISA a granel no permite distinguir entre Aβ40 en la vasculatura versus placa, y es posible que Aβ40 también se deposite abundantemente en placas en este modelo de ratón; la reducción de Aβ40 total por ELISA en ratones sin APOE4 astrocítico puede ser, por lo tanto, un reflejo de la reducción de la placa. Por lo tanto, también medimos el porcentaje de cobertura del área de Aβ40 y Aβ42 localizados en placas o vasos mediante inmunotinción (Fig. 3e-t). En ratones que carecían de APOE4 astrocítico, hubo una disminución en Aβ40 total (Fig. 3f) y Aβ40 en placas (Fig. 3h), pero no en Aβ40 vascular (Fig. 3g). Sin embargo, hubo un cambio en la proporción de depósito de Aβ40 en los vasos en ratones con APOE4 astrocítica (~ 20 %) en comparación con los que no la tenían (~ 60 %), lo que sugiere que sin APOE4 astrocítica, los péptidos Aβ40 se agregaron a niveles comparables en los vasos, pero posiblemente se eliminaron o degradaron más rápidamente en el parénquima cerebral (Fig. 3i). Esto está respaldado por nuestros datos ELISA que revelaron una disminución en Aβ40 soluble pero no en Aβ42 (Fig. 3a, b), posiblemente como resultado de una eliminación más rápida de Aβ40. Analizamos aún más la deposición regional de Aβ40 evaluando su cobertura en los vasos leptomeníngeos a lo largo de la superficie del cerebro en comparación con los vasos penetrantes en el parénquima cerebral. No hubo cambios en la acumulación pial de Aβ40 (Fig. 3j); sin embargo, hubo un aumento del doble en el depósito de Aβ40 en los vasos penetrantes del parénquima cerebral (Fig. 3k, P = 0,073; Fig. 3l, P = 0,065). Esto sugiere que después de que las neuronas liberan Aβ40 en el parénquima cerebral, existe una reserva de Aβ40 que no se agrega con las placas. En su lugar, los péptidos Aβ40 pueden ser transportados a través del líquido intersticial y la vía de drenaje perivascular a lo largo de las arterias parenquimatosas donde se agregan o salen a través de las arterias piales/LCR. Curiosamente, no hay una reducción significativa de Aβ42 total (las formas solubles o insolubles son indistinguibles por histología; Fig. 3m, n), aunque detectamos una disminución en la acumulación de Aβ42 en las placas (Fig. 3p). Un análisis adicional demostró una falta de diferencia entre la acumulación de Aβ42 vascular pial versus penetrante (Fig. 3r-t), lo que respalda los hallazgos anteriores de que Aβ40 se agrega preferentemente alrededor de los vasos y puede contribuir a una mayor acumulación de CAA en ratones que carecen de APOE4 astrocítico.

La APOE4 astrocítica regula la distribución del depósito de Aβ40 y Aβ42 en placas, vasos parenquimatosos y vasos leptomeníngeos. a-d, concentraciones de proteína Aβ40 y Aβ42 solubles en PBS y guanidina-HCL ("insolubles") evaluadas por ELISA de la corteza. Inmunorreactividad e-h Aβ40 (IR) (e) con cobertura de área porcentual de Aβ40 total (f), Aβ40 vascular total (g) y Aβ40 en placas (h). i Proporción de Aβ40 vascular en Aβ40 IR total. j, k Aβ40 IR restringido a vasos piales (j) y vasos penetrantes (k). (l) Proporción de Aβ40 vascular en vasos penetrantes del total de Aβ40 vascular. m–p, inmunorreactividad (IR) de Aβ42 (m) con porcentaje de cobertura de área de Aβ42 total (n), Aβ42 vascular total (o) y Aβ42 en placas (p). q Proporción de Aβ42 vascular en Aβ42 IR total. r, s, Aβ42 IR restringida a vasos piales (r) y vasos penetrantes (s). t Proporción de Aβ42 vascular en vasos penetrantes del total de Aβ42 vascular. Flecha azul = Aβ vascular. Flechas moradas = placas. Barra de escala: 500 µm. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (d), donde se realizó la prueba t de Welch. ∆ = hombres, ○ = mujeres. *P < 0,05, *P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique

La recombinación mediada por Cre para eliminar la APOE4 astrocítica en nuestro modelo de ratón redujo los niveles generales de proteína y ARNm de APOE. Para evaluar la magnitud del cambio de expresión de APOE4 a nivel celular, investigamos la distribución espacial y la expresión de APOE4 en dos tipos principales de células que regulan al alza un perfil transcripcional asociado a la enfermedad en respuesta a la patología Aβ [57, 58]: astrocitos y microglía. Como era de esperar, sin recombinación Cre (ratones 5X+AL-), APOE se localizó principalmente en astrocitos GFAP+ y microglía IBA1+ que rodea CAA o placas; sin embargo, también hubo expresión de APOE en astrocitos en regiones corticales desprovistas de depósito de amiloide pero no en microglia (Figura S4a). La eliminación de APOE4 de los astrocitos resultó en una disminución general de la proteína APOE4 en las regiones corticales con o sin CAA/patología de placa (Figura S4a, b). La reducción de APOE fue exclusiva de los astrocitos GFAP+ (Figura S4c) y no se observó en la microglía IBA1+ (Figura S4d), lo que indica que la expresión de APOE4 en la microglía no se vio alterada. En conjunto, nuestros resultados sugieren que logramos una fuerte reducción de la proteína APOE4 específica de los astrocitos.

A continuación, para evaluar los efectos de la eliminación de APOE4 en la gliosis mediada por Aβ, evaluamos el patrón de expresión de los astrocitos y la microglía en la corteza. La tinción para astrocitos GFAP+ reveló una reducción general de la reactividad astrocítica cortical GFAP+ en ausencia de expresión astrocítica de APOE4 (Fig. 4a, b). En el subículo dorsal, una región sin reducción total de amiloide (Figura S3), tampoco hubo cambios en la cobertura del área de GFAP (Figura S5), lo que inicialmente sugiere que el amiloide, independientemente del compartimento en el que se deposite, impulsa la astrocitosis reactiva de GFAP+. Sin embargo, el coanálisis de astrocitos GFAP+ con placas de amiloide X34+ o CAA reveló que aunque hubo una fuerte respuesta de los astrocitos GFAP+ que rodeaban las placas restantes en astrocitos sin APOE4, hubo menos reactividad de astrocitos GFAP+ con CAA (Fig. 4c-e). Aunque APOE4 se redujo notablemente en los astrocitos alrededor de las placas y CAA, el porcentaje de área cubierta por los astrocitos GFAP+ que rodean las placas se mantuvo independientemente de la expresión de APOE4. Esto sugiere que una vez que se forman las placas de amiloide, la reactividad astrocítica se puede mantener de manera independiente de APOE. Además, los astrocitos GFAP+ reactivos pueden sufrir una remodelación morfológica distinta, de modo que los astrocitos en un estado más "homeostático" pueden mostrar procesos altamente ramificados, mientras que los astrocitos "reactivos" tienen procesos más retraídos e hipertrofiados, según el insulto o la lesión. Para diferenciar entre los astrocitos con o sin APOE4 que rodean CAA frente a las placas, evaluamos la morfología de los astrocitos reactivos con GFAP. En general, la eliminación de APOE4 de los astrocitos no modificó el tamaño o la complejidad de su morfología (Figura S6a-f). Sin embargo, los astrocitos que interactúan con las placas frente a CAA muestran una morfología alterada: los astrocitos que contactan con las placas tenían un mayor número (Figura S6c) y una mayor duración de los procesos (Figura S6d), marcados por una mayor arborización (Figura S6e). Sin embargo, en promedio, estos procesos fueron más cortos (Figura S6f), representativos de numerosos procesos terminales retraídos e implicando que las placas de amiloide pueden inducir diferencias sutiles, como una mayor toxicidad que CAA para los astrocitos asociados. Combinados, estos hallazgos sugieren que se asociaron menos astrocitos GFAP+ con CAA después de la eliminación de APOE4 astrocitario y que adoptaron un estado morfológico que posiblemente fue menos reactivo que los que entraron en contacto con las pocas placas que quedaron. Se necesitan más lecturas, incluidas las funcionales, para comprender la complejidad de estos astrocitos que rodean las placas/CAA.

El agotamiento de APOE en los astrocitos disminuye ciertas firmas gliales asociadas a enfermedades. a–e, tinción astrocítica GFAP+ (a) y cuantificación del área de cobertura (b) en la corteza de ratones 5X+AL- o 5X+AL+ de 10 meses de edad. Barra de escala: 300 µm. Imágenes representativas (c) y cuantificación del número de astrocitos que rodean CAA (d) o placas (e). Barra de escala: 20 µm. Cada punto representa el número de astrocitos que rodean un solo CAA o placa normalizados a ese CAA o área de placa de n = 8–10 ratones por grupo. f–j, cobertura microglial IBA1+ (f) y cuantificación del área de cobertura (g) en la corteza que recubre el hipocampo. Barra de escala: 300 µm. Análisis por placa del número de agrupaciones de microglia CAA (h, i) o placas (j). Barra de escala: 20 µm. Cada punto representa el número de microglías que rodean un solo CAA o placa normalizado a ese CAA o área de placa de n = 8–10 ratones por grupo. k, l, Expresión relativa de ARNm de genes astrocíticos (k) y microgliales (l) homeostáticos y asociados a enfermedades. Datos imputados para el ARNm de Clec7a (columna 10) pero no utilizados en el análisis estadístico. Cada columna representa un ratón individual. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (d), (e), (k – S100β) y (l – Cst7, Cst3, Itgax, Spp1) donde Welch's Se realizó la prueba t. ∆ = hombres, ○ = mujeres. *P < 0,05, **P < 0,01. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique

Dado que hubo una respuesta astrocítica GFAP+ amortiguada en general después de la eliminación de los astrocitos APOE4, nos interesó saber si la diafonía astrocito-microglia se vio afectada. Para abordar esta pregunta, evaluamos la respuesta microglial con tinción de IBA1. No detectamos cambios en la microglía IBA1 + en la corteza o en el nivel de placa / CAA por inmunohistoquímica (Fig. 4f-j). Cuando investigamos genes gliales asociados a enfermedades específicas mediante PCR cuantitativa (qPCR), detectamos reducciones en la expresión de genes astrocíticos reactivos, incluso en Gfap y C3 (Fig. 4k) en la corteza. Curiosamente, también detectamos reducciones en los genes de microglía asociada a la enfermedad (DAM) / enfermedad neurodegenerativa microglial (MGnD) como Cst7, Clec7a y Spp1 (Fig. 4l), lo que sugiere que la microglía adoptó un estado amortiguado DAM / MGnD a pesar de que no hubo cambios en Tinción de microglía IBA1+. En resumen, estos datos sugieren que a pesar de la elevación de CAA en el cerebro luego de la eliminación del astrocito APOE4, hubo una reducción de varios genes microgliales y astrocíticos asociados con la enfermedad. Esto sugiere un estado glial modificado, posiblemente debido a especies y conformación de Aβ alteradas que pueden ser protectoras en el cerebro y la vasculatura cerebral y que buscamos confirmar en ensayos funcionales de seguimiento.

A pesar del aumento de CAA, determinamos que la eliminación de APOE4 astrocítico redujo la neuroinflamación asociada a la enfermedad, un resultado que puede proporcionar protección aguas abajo al SNC. Para evaluar si la reducción de APOE4 brinda neuroprotección a los procesos neurales asociados con la placa y CAA, evaluamos la distrofia neurítica mediante el etiquetado de LAMP1, un marcador lisosomal que está altamente enriquecido en axones grandes e hinchados que rodean amiloide y CAA [59, 60]. En la corteza, la ausencia de APOE4 astrocítico resultó en neuritas distróficas LAMP1 + significativamente reducidas (Fig. 5a, b). Un análisis posterior reveló que hubo una disminución en la reactividad de LAMP1+ alrededor de CAA (Fig. 5c), mientras que la inmunorreactividad de LAMP1 aumentó alrededor de las placas fibrilares parenquimatosas restantes (Fig. 5d), similar a lo que se ha observado en ratones knockout para APOE que depositan amiloide [61 ]. Debido a que la distrofia neurítica generalmente es más prominente alrededor de las placas que la CAA, la reducción general de la distrofia neurítica en la corteza de los ratones sin APOE4 astrocitario probablemente fue impulsada por la notable reducción de las placas fibrilares totales en el parénquima.

La eliminación de APOE astrocítica protege contra las neuritas distróficas. a–d, tinción de LAMP1 para neuritas distróficas (a) con cuantificación del porcentaje de LAMP1 total en la corteza (b), porcentaje de cobertura de área de tinción de LAMP1 alrededor de CAA normalizado al porcentaje de área cubierta por X34+ CAA (c) y porcentaje de área cobertura de tinción LAMP1 alrededor de placas normalizada al porcentaje de área cubierta por placas X34+ (d). Barra de escala: 200 µm. Puntas de flecha moradas: LAMP1 alrededor de las placas. Puntas de flecha azules: LAMP1 alrededor de CAA. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (b) y (c), donde se realizó la prueba t de Welch. ∆ = hombres, ○ = mujeres. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique

La interrupción de la integridad cerebrovascular es un sello distintivo de la CAA que puede provocar la interrupción de la BHE y la pérdida de la función fisiológica de los vasos. Para determinar si la BBB estaba comprometida en ratones 5X+AL+ que mostraban una mayor carga de CAA, teñimos para detectar la presencia de fibrinógeno, una proteína derivada de la sangre que normalmente no puede ingresar al parénquima cerebral (Fig. 6a). Sorprendentemente, a pesar del aumento de CAA, se redujo la extravasación de fibrinógeno después de la eliminación del astrocito APOE4 (Fig. 6b). También investigamos si el CAA elevado aumentaba las microhemorragias inducidas por CAA, pero no encontramos diferencias en la cantidad de microhemorragias entre los grupos (P = 0.07; Fig. 6c, d). La reducción de fibrinógeno de los ratones de control nos llevó a probar si los vasos cargados de CAA también exhiben una función vascular mejorada. El depósito de CAA en la capa de células musculares lisas (SMC) hace que las arteriolas respondan menos a las moléculas que estimulan la vasodilatación. En ratones vivos y despiertos, infundimos tópicamente un vasodilatador SMC (S-Nitroso-N-acetilpenicilamina, SNAP) que conduce a la producción de óxido nítrico y medimos la respuesta vasodilatadora en vasos leptomeníngeos que contienen CAA en la superficie del cerebro (Fig. 6e ). En relación con los ratones 5XFAD que expresan APOE4, encontramos que SNAP condujo a un aumento significativo de la vasodilatación en ratones 5XFAD después de la eliminación del astrocito APOE4 (Fig. 6f). Por lo tanto, la eliminación de astrocitos proporcionó protección para la BBB y promovió la vasorreactividad en las SMC. En resumen, nuestros resultados indican que la ausencia de APOE4 de los astrocitos resultó en más CAA pero menos placas parenquimatosas que redujeron la gliosis asociada a Aβ y mejoraron la función cerebrovascular.

La degeneración vascular mejora a pesar de la CAA elevada. a, b Tinción para la proteína fibrinógeno derivada de la sangre (a) con cuantificación del área porcentual cubierta (b) en la corteza de ratones 5X+AL- o 5X+AL+ de 10 meses de edad. Flecha amarilla: tinción de fibrinógeno. Barra de escala: 100 µm. c, d, Número medio de microhemorragia (c) y tamaño (d) mediante tinción con azul de Prusia. e, f, Evaluación in vivo de la función leptomeníngea medida por el porcentaje de cambio vasodilatador desde el inicio después de la aplicación tópica de molécula dependiente de células de músculo liso vascular (SNAP). Puntas de flecha moradas: Aumento de la dilatación. Puntas de flecha azules: sin cambios en la dilatación. Datos de 9 vasos en 4 ratones (5X+AL-) y 6 vasos en 3 ratones (5X+AL+). Barra de escala: 15 µm. SNAP = S-Nitroso-N-acetilpenicilamina. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (c) y (d), donde se realizó la prueba t de Welch. ∆ = hombres, ○ = mujeres. *P < 0,05, ***P < 0,001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique

El alelo ε4 de APOE influye fuertemente en el riesgo de AD y CAA. APOE4 deteriora y/o compite con Aβ por la eliminación, además de acelerar la siembra y la fibrilogénesis de Aβ, lo que potencialmente impulsa el inicio más temprano de la patología Aβ en los portadores de APOE4 con AD. De manera similar, los portadores de APOE4 con CAA tienen una prevalencia acelerada y una mayor gravedad de CAA [5, 12], con el riesgo adicional de un inicio de hemorragia más temprano [13]. Los mecanismos subyacentes de las contribuciones de APOE4 a CAA no están claros. Recientemente, nuestro laboratorio demostró que la eliminación de APOE4 secretada por los astrocitos es suficiente para reducir fuertemente la carga de placa parenquimatosa de Aβ [48], así como la neurodegeneración mediada por tau [49] al alterar potencialmente la diafonía entre astrocito y microglía. En este estudio actual, nuestro objetivo fue investigar las contribuciones de la APOE4 astrocítica a la CAA y la disfunción vascular asociada a la CAA.

Nuestro grupo ha demostrado previamente que la ablación genética de la APOE murina es suficiente para prevenir el desarrollo de CAA en ratones que depositan Aβ [25]. Sin embargo, la ablación genética completa de APOE en todo el cuerpo puede no ser un enfoque terapéutico viable dado el papel crítico de APOE tanto periférico como derivado del cerebro en el metabolismo de los lípidos. Por lo tanto, nos preguntamos si la eliminación selectiva de APOE de los astrocitos, los principales productores de APOE en el cerebro, es suficiente para reducir el daño vascular relacionado con CAA y CAA. Presumimos que la reducción de los niveles de APOE4 total mediante la eliminación de APOE4 astrocítico (reducción de ~ 75 % del APOE4 total) reduciría tanto la placa de Aβ como la carga de CAA en un modelo de ratón de depósito mixto de CAA/placa (5X+AL+). De hecho, las placas de Aβ y amiloide se redujeron en ratones 5X+AL+. Curiosamente, sin embargo, hubo un aumento concomitante en CAA de tal manera que la deposición de Aβ cambió de ~ 50 % a ~ 20 % en placas parenquimatosas y de ~ 50 % a ~ 80 % en CAA. De manera similar a los hallazgos anteriores, las placas amiloides parenquimatosas restantes en ratones sin APOE4 astrocítico tienen una morfología de núcleo más disperso que denso [48]. Sin embargo, para nuestra sorpresa, el aumento de CAA encontrado en ausencia de APOE4 astrocítico no exacerbó el daño asociado a CAA, sino que promovió una función vascular mejorada. A continuación, discutimos (1) posibles explicaciones para el cambio de Aβ del parénquima cerebral a la vasculatura cerebral, (2) el efecto protector de la eliminación de APOE en la vasculatura cerebral a pesar del aumento de Aβ vascular, y (3) las implicaciones de nuestros hallazgos en APOE- terapéuticas basadas

En el cerebro, APOE puede actuar como una "semilla" para autoensamblarse [62] o unirse directamente a Aβ para la fibrilación [63,64,65,66,67]. De hecho, en ausencia de APOE, los ratones transgénicos que depositan placas de Aβ tienen una mayor eliminación de Aβ soluble [68], lo que sugiere que APOE compite con Aβ por la eliminación y/o retiene Aβ en el cerebro para reducir la eliminación. El Aβ se elimina del cerebro a través de la vía perivascular [10], transcitosis BBB [69], captación celular [70] y/o flujo masivo de líquido intersticial/líquido cefalorraquídeo (ISF/CSF) [71]. APOE es necesario para "sembrar" Aβ en fibrillas en la vasculatura para el desarrollo de CAA [25]. En nuestro estudio, redujimos la concentración de proteína total de APOE4 en el cerebro en ~ 75 %. El APOE4 restante, derivado de la microglia asociada a la enfermedad, macrófagos perivasculares, células endoteliales, pericitos, fibroblastos perivasculares o células de músculos lisos [72], probablemente contribuyó al desarrollo de CAA. Aunque se desconocen las contribuciones de APOE derivadas de varios tipos de células en la fibrilación de Aβ, los datos actuales sugieren que las partículas de APOE secretadas por la microglía son más pequeñas (y, por lo tanto, menos lipidadas) que las de los astrocitos [53]. Actualmente no conocemos las propiedades moleculares de la APOE secretada por las células murales vasculares y sus contribuciones exactas a la CAA, aunque los pericitos APOE4 pueden desempeñar un papel importante en la progresión de la enfermedad [37]. Independientemente, estos hallazgos sugieren que la APOE de distintas fuentes celulares puede tener un potencial de siembra de Aβ diferente. Curiosamente, otros estudios en ratones genéticamente modificados han demostrado que la alteración de la función microglial a un estado menos fagocítico [73] o el agotamiento de la microglia, ya sea farmacológicamente [74] o genéticamente [75], todo lo cual probablemente disminuye la APOE secretada por microglial, aumenta la cantidad de CAA. No se ha determinado hasta qué punto se altera la APOE, aunque un estudio en un modelo de tauopatía en ratones detectó un mecanismo compensatorio en el que había un aumento de la proteína APOE en los astrocitos y las neuronas después de la ablación farmacológica de la microglía [76]. Además, la pérdida de clusterina (APOJ), otra apolipoproteína altamente expresada en el cerebro que se deposita en placas parenquimatosas y CAA [77], aumentó el depósito de CAA [78]. Es posible que, independientemente de la fuente celular de APOE, una reducción imparcial de la APOE del SNC pueda conducir a una menor agregación de Aβ y, por lo tanto, a una menor retención de Aβ en el parénquima cerebral. El Aβ soluble producido en el cerebro y liberado en el ISF del cerebro se elimina en parte a través de la vía perivascular, una fuente probable de Aβ que se deposita como CAA. Según un estudio relacionado, la eliminación de APOE astrocítica no afectó la escisión y la producción de APP [48], lo que sugiere que el cambio en la localización de Aβ no fue el resultado de una producción alterada de Aβ. Aunque detectamos un aumento de dos veces en Aβ40 en los vasos penetrantes, se desconoce si esto es el resultado de una mayor eliminación perivascular. Por lo tanto, sería de interés para el futuro determinar si el ISF y el aclaramiento de Aβ perivascular están alterados en estos modelos de ratón, incluido el nuestro con pérdida de APOE4 astrocítico. Los experimentos futuros en los que APOE4 se elimine selectivamente de varios tipos de células del SNC podrían proporcionar información valiosa sobre el papel del APOE específico de la célula en la patogénesis de la placa/CAA.

En nuestro estudio actual, quizás nuestro hallazgo más sorprendente fue que la eliminación de APOE4 astrocítico condujo a un aumento de CAA pero protegió la vasculatura cerebral. Los astrocitos tienen funciones basales críticas, que incluyen brindar apoyo neurotrófico, regular la homeostasis de iones y crear una barrera física desde el espacio perivascular [79, 80]. A lo largo de la vasculatura cerebral, los pies terminales astrocíticos perivasculares ocupan una barrera que permite el flujo de moléculas selectivas [80]. Sin embargo, bajo condiciones patológicas como CAA o con un desafío inflamatorio [81], los astrocitos perivasculares homeostáticos pueden adoptar un fenotipo neurotóxico [42] y pueden tener una función basal aberrante como la incapacidad de regular los canales de agua (acuaporina 4) importantes para el transporte de solutos. [46, 82]. En condiciones patológicas, APOE aumenta en los astrocitos, denominados astrocitos asociados a enfermedades (DAA) [41]. La eliminación de APOE4 de un modelo de ratón con amiloidosis reduce la reactividad de GFAP en ratones macho [48], mientras que la secuenciación de ARN de un solo núcleo en un modelo de ratón con tauopatía ha revelado que se reducen numerosos genes DAA como Clu y Vim [49]. En nuestro estudio, también detectamos una reducción de genes DAA seleccionados, incluidos C3 y Gfap, lo que sugiere que la eliminación de APOE4 puede revertir los astrocitos patológicos a un estado más homeostático que de alguna manera permite la protección y el apoyo a la vasculatura cerebral. A partir de nuestro análisis morfológico de astrocitos, no hubo cambios manifiestos en ratones con o sin agotamiento de APOE4 astrocítico que indicarían el estado de estos astrocitos; sin embargo, los astrocitos GFAP+ aparentemente responden de manera diferente a las placas frente a CAA. Se necesitan más estudios centrados en los astrocitos asociados a BBB para comprender su papel en el contexto de una enfermedad y si este estado es transitorio y/o reversible.

La terapia APOE ha sido un tema de interés reciente como una estrategia novedosa para atacar múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluidas la EA y la CAA. Varias estrategias, incluida la inmunoterapia APOE [54, 55, 83], los oligonucleótidos antisentido [84] y los péptidos miméticos APOE [85, 86], entre otros, han demostrado ser promisorios preclínicos para el tratamiento de la amiloidosis sin efectos adversos manifiestos en la vasculatura cerebral o los lípidos periféricos. homeostasis Sin embargo, la mayoría de estos estudios no se realizaron en ratones con CAA, que es una característica neuropatológica detectada en prácticamente todos los pacientes con EA. Este estudio actual identificó que en un modelo de ratón de patología mixta CAA/placa, la eliminación de una fuente importante de APOE producida por los astrocitos aumentó la CAA pero brindó protección al reducir la distrofia neurítica y mejorar el daño vascular inducido por CAA. Tanto APOE4 como CAA han sido implicados para exacerbar el daño en el cerebro con EA [4], y los estudios futuros que investiguen APOE deberían incorporar el uso y el análisis de CAA además de las placas de Aβ para modelar con mayor precisión la patología humana de Aβ. Recientemente, nuestro grupo generó un anticuerpo que se dirige selectivamente a una forma de APOE4 no lipidada que solo se encuentra en las placas amiloides y CAA [54] y comparó sus efectos directamente contra un anticuerpo dirigido a Aβ. Cuando el anticuerpo dirigido contra Aβ se administró a ratones 5XFAD/APOE4 que desarrollaron CAA y placas, no disminuyó CAA y dio como resultado un aumento en los astrocitos GFAP+ que recubren CAA que se correlacionó fuertemente con microhemorragias, un efecto adverso importante en respuesta a cierta inmunoterapia con Aβ. [54]. Por el contrario, el anticuerpo anti-APOE disminuyó la CAA, mejoró la función vascular y no dio lugar a un aumento de las microhemorragias o de los astrocitos GFAP+ que recubren la CAA [54]. Teniendo en cuenta nuestros hallazgos actuales, sería especialmente relevante para los desafíos actuales de la inmunoterapia Aβ determinar si la modificación genética o farmacológica de estos astrocitos GFAP+ proporcionaría protección neurovascular y atenuaría los efectos adversos vasculares mediados por anticuerpos Aβ. Dado que los efectos adversos vasculares (anomalías en las imágenes relacionadas con el amiloide, ARIA) son un revés importante para muchos anticuerpos dirigidos contra Aβ, esta es una cuestión crítica que debe resolverse.

APOE4 y CAA son factores de riesgo importantes para la disfunción vascular [87] por mecanismos compartidos y dispares. Nuestro estudio ha descubierto que atenuar la patología de APOE4 al reducir la producción de APOE4 astrocítico es suficiente para brindar protección contra el daño vascular asociado con CAA, incluida la mejora de la fuga de BHE y la vasorreactividad. La eliminación de APOE4 puede revertir los astrocitos, incluidos los astrocitos asociados con CAA, de un estado patológico a un estado fisiológico que es neuroprotector y vascular. Estos resultados sugieren que existe un potencial terapéutico al utilizar estrategias dirigidas a APOE para el tratamiento de CAA y AD, pero se necesitan más estudios de seguimiento para desvincular la compleja relación entre las contribuciones de APOE específicas de células al desarrollo de CAA y la función vascular.

Los conjuntos de datos generados utilizados para los análisis en este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

5 mutaciones AD familiares

amiloide-β

enfermedad de Alzheimer

Proteína precursora de amiloide

Apolipoproteína E

Apolipoproteína J

Anormalidades de imagen relacionadas con amiloide

Angiopatía amiloide cerebral

Sistema nervioso central

Fluido cerebroespinal

Astrocitos asociados a enfermedades

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Proteína ácida fibrilar glial

Molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1

Líquido intersticial

intraperitoneal

Proteína 1 de membrana asociada a lisosomas

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

Célula muscular lisa

S-Nitroso-N-acetilpenicilamina

Solución salina tamponada con Tris

Attems J, Jellinger KA, Lintner F. La patología de la enfermedad de Alzheimer influye en la gravedad y la distribución topográfica de la angiopatía amiloide cerebral. Acta Neuropathol. 2005; 110:222–31.

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Agradecemos a R. Vassar por regalar ratones 5XFAD (línea 7031), Animal Surgery Core en el Hope Center for Neurological Disorders por las consultas sobre cirugías en ratones, M. Miracle por los guiones, J. Jankowsky por el protocolo de inmunofluorescencia Aβ40, D. Seo por consultas sobre análisis morfológico de astrocitos, y el Centro de Acceso a la Tecnología del Genoma en el Departamento de Genética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington para el análisis genómico.

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del NIH AG062027 (MX), RF1NS090934 (DMH), RF1AG047644 (DMH), R01 NS034467 (DMH), P01 AG078106 (DMH), la fundación BrightFocus A2018128F (CW) y A2020257F (MG), Cure Alzheimer's Fund (DMH), y la Fundación JPB (DMH). Las imágenes escaneadas en el sistema de patología digital Hamamatsu NanoZoomer son cortesía del Hope Center Alafi Neuroimaging Laboratory.

Monica Xiong, Chao Wang, Maud Gratuze contribuyeron igualmente.

Departamento de Neurología, Centro Hope para Trastornos Neurológicos, Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Knight, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Monica Xiong, Maud Gratuze, Fareeha Saadi, Xin Bao, Megan E. Bosch, Choonghee Lee, Hong Jiang, Javier Remolina Serrano, Ernesto R. Gonzales, Michal Kipnis & David M. Holtzman

División de Biología y Ciencias Biomédicas (DBBS), Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Mónica Xiong

Dirección actual: Genentech, 1 DNA Way, South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Mónica Xiong

Instituto de Ciencias y Enfermedades del Cerebro, Universidad Médica de Chongqing, Chongqing, 400016, China

chao wang

Dirección actual: Instituto de Neurofisiopatología (INP UMR7051), CNRS, Aix-Marseille Université, Marseille, 13005, Francia

Maud Gratuze

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MX y DMH concibieron y diseñaron el estudio. MX, CW, MG y DMH analizaron los datos. MX, CW y MG realizaron la mayoría de los experimentos, asistidos por XB, FS, MEB, HJ, JRS, CL y MKCW, MX, XB y JRS realizaron las inyecciones de tamoxifeno. FS realizó el análisis morfológico de astrocitos. MX y ERG realizaron el estudio de función de los vasos. MX y DMH escribieron el manuscrito con aportes de todos los coautores. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a David M. Holtzman.

No aplica.

No aplica.

MX es un empleado de Genentech. DMH es inventor de una patente con licencia de la Universidad de Washington para NextCure sobre el uso terapéutico de anticuerpos anti-APOE. DMH cofundó y forma parte del consejo asesor científico de C2N Diagnostics. DMH forma parte del consejo asesor científico de Denali, Genentech y Cajal Neuroscience y asesora a Alector. Todos los demás autores declaran que no tienen intereses contrapuestos que revelar.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

No hay diferencias de sexo en la expresión de ARNm de APOE4 ni en las concentraciones de proteína en ratones con o sin expresión de Cre. a, Expresión relativa de ARNm de APOE normalizado a beta-actina en la corteza. b, c, concentraciones de proteína APOE soluble en PBS y soluble en guanidina-HCL ("insoluble") evaluadas por ELISA de la corteza. Datos expresados ​​como media ± SD, ANOVA de dos vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak realizada para todos los análisis estadísticos. Ninguna comparación estadística es significativa a menos que se indique.

No hay diferencias de sexo en la patología amiloide o Aβ en ratones con o sin expresión de Cre. a–c, tinción X34 para placas fibrilares/CAA con cobertura de área porcentual del total de X34 (a), CAA (b) y placas de amiloide (c) en la corteza que recubre el hipocampo de 5X+AL- o de 10 meses de edad Ratones 5X+AL+ después de la eliminación de APOE4 astrocítico a los 2 meses de edad. d-f, inmunorreactividad de Aβ (Aβ-IR) con porcentaje de cobertura de área de Aβ-IR total (d), Aβ-IR vascular (e) y placas (f) en la corteza que recubre el hipocampo. Datos expresados ​​como media ± SD, ANOVA de dos vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak realizada para todos los análisis estadísticos. Ninguna comparación estadística es significativa a menos que se indique.

Aumento de CAA y reducción de placas de amiloide en el subículo, aunque sin cambios en el amiloide general. a–d, tinción X34 para placas fibrilares/CAA (a) con cobertura de área porcentual del total de X34 (b), CAA (c) y placas de amiloide (d) en el subículo dorsal de 5X+AL- de 10 meses de edad o ratones 5X+AL+ después de la eliminación de APOE4 astrocitario a los 2 meses de edad. e, Proporción de CAA en la tinción X34+ total. Barra de escala: 300 µm. ∆ = hombres, ○ = mujeres. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (b), donde se realizó la prueba t de Welch. **P < 0,01, ***P < 0,001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique.

Reducción inducida por tamoxifeno de APOE4 astrocítico en regiones corticales con y sin CAA/placas. a, Imágenes representativas de X34 para placas amiloides/CAA, APOE, astrocitos GFAP+ y microglía IBA1+. Punta de flecha: APOE en astrocito. Flecha: APOE en microglia. Barra de escala: 50 µm. b, Porcentaje de cobertura APOE en regiones corticales con CAA, placas, o sin CAA/placas. c, d, Relación de APOE en astrocitos GFAP+ (c) o IBA1+ (d) cobertura del área de microglía normalizada a CAA/carga de placa. ∆ = hombres, ○ = mujeres. Datos expresados ​​como media ± SEM, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos excepto (b: sin placas, CAA, placas), (c: sin placas, CAA, placas) y (d: sin placas , CAA), donde se realizó la prueba t de Welch. *P < 0,05, **P < 0,01. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique.

Sin cambios en la cobertura de astrocitos GFAP+ en el subículo. a, b, tinción de GFAP para astrocitos (a) con porcentaje de cobertura de área de inmunorreactividad total de GFAP (b) en el subículo dorsal de ratones 5X+AL- o 5X+AL+ de 10 meses de edad después de la eliminación de APOE4 astrocitario a los 2 meses -de edad. Barra de escala: 300 µm. ∆ = hombres, ○ = mujeres. Datos expresados ​​como media ± SD, prueba t de Student (bilateral) realizada para todos los análisis estadísticos. Ninguna comparación estadística es significativa a menos que se indique.

Caracterización de respuestas morfológicas de astrocitos GFAP+ a CAA o placas. a, Reconstrucción representativa de astrocitos GFAP+ alrededor de CAA o placas amiloides utilizando Simple Neurite Tracer. b – f, análisis morfológicos de GFAP + tamaño de astrocitos (análisis de casco convexo) (b), número de procesos (c), longitud total de procesos (d), número de puntos de ramificación (e) y longitud media del proceso (f). Barra de escala: 50 µm. ∆ = hombres, ○ = mujeres. Datos expresados ​​como media ± SD, ANOVA de dos vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak realizada para todos los análisis estadísticos. *P < 0,05, **P < 0,01. *** P < 0,001. Ninguna otra comparación estadística es significativa a menos que se indique.

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Reimpresiones y permisos

Xiong, M., Wang, C., Gratuze, M. et al. La eliminación de APOE4 astrocítica confiere protección cerebrovascular a pesar del aumento de la angiopatía amiloide cerebral. Mol Neurodegeneración 18, 17 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00610-x

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Recibido: 01 Septiembre 2022

Aceptado: 02 de marzo de 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00610-x

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