Base estructural para la señalización de la hormona FGF

Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Los correceptores α/βKlotho interactúan simultáneamente con las hormonas del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (FGF19, FGF21 y FGF23)1,2 y sus receptores de FGF de superficie celular afines (FGFR1–4), estabilizando así el complejo endocrino FGF-FGFR3,4,5,6 . Sin embargo, estas hormonas aún requieren proteoglicano de sulfato de heparán (HS) como un correceptor adicional para inducir la dimerización/activación de FGFR y, por lo tanto, provocar sus actividades metabólicas esenciales6. Para revelar el mecanismo molecular que sustenta el papel del correceptor de HS, resolvimos las estructuras de microscopía crioelectrónica de tres complejos cuaternarios 1: 2: 1: 1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS distintos que presentan las isoformas de empalme 'c' de FGFR1 (FGFR1c) , FGFR3 (FGFR3c) o FGFR4 como componente receptor. Estas estructuras, respaldadas por experimentos de heterodimerización y complementación de receptores basados ​​en células, revelan que una sola cadena de HS permite que FGF23 y su FGFR primario dentro de un complejo ternario 1: 1: 1 FGF23-FGFR-αKlotho recluten conjuntamente una molécula de FGFR secundaria solitaria que conduce a dimerización y activación asimétrica del receptor. Sin embargo, αKlotho no participa directamente en el reclutamiento del receptor secundario/dimerización. También mostramos que el modo asimétrico de dimerización del receptor es aplicable a los FGF paracrinos que emiten señales únicamente de manera dependiente de HS. Nuestros datos estructurales y bioquímicos anulan el actual paradigma de dimerización simétrica de FGFR y proporcionan planos para el descubrimiento racional de moduladores de señalización de FGF2 como terapias para enfermedades metabólicas humanas y cáncer.

La familia del factor de crecimiento de fibroblastos de mamíferos (FGF) comprende 18 polipéptidos que contienen el dominio de homología de trébol β dispuestos en cinco subfamilias paracrinas y una subfamilia endocrina7. Las subfamilias paracrinas gobiernan múltiples eventos durante el desarrollo embrionario8 mientras que los miembros de la subfamilia endocrina (FGF19, FGF21 y FGF23) son hormonas que regulan la homeostasis de los ácidos biliares, los lípidos, la glucosa, la vitamina D y los iones minerales1,4,9,10. Las hormonas FGF son objetivos prometedores para el tratamiento de un espectro de enfermedades metabólicas, que incluyen diabetes tipo II, obesidad, esteatohepatitis no alcohólica, cirrosis biliar primaria, diarrea de ácidos biliares, trastornos renales con pérdida de fosfato y enfermedad renal crónica2,11,12,13, 14,15,16,17,18,19. Los FGF median sus acciones mediante la unión, la dimerización y, por lo tanto, la activación de tirosina quinasas receptoras de FGF transmembrana de un solo paso (FGFR1–4)20,21. La región extracelular de un FGFR prototípico contiene tres dominios similares a inmunoglobulina (Ig) (D1, D2 y D3). D2, D3 y el enlazador corto D2-D3 son necesarios y suficientes para la unión del ligando y la dimerización del receptor. En FGFR1-FGFR3, el empalme alternativo de dos exones mutuamente excluyentes (denominados 'b' y 'c') altera la composición de los principales sitios de unión de ligandos dentro de los dominios D3 de estos tres FGFR, lo que amplía efectivamente el número de isoformas principales de FGFR a siete (es decir, FGFR1b–3b, FGFR1c–3c y FGFR4)22,23,24.

Los FGF paracrinos dependen de los glicosaminoglicanos de sulfato de heparán (HS) como un correceptor obligatorio para unirse y dimerizar de forma estable sus FGFR afines. Los HS son cadenas de glicanos lineales de proteoglicanos de HS (HSPG) que se expresan abundantemente en la matriz extracelular de todos los tejidos25. De acuerdo con la estructura cristalina del dímero 2:2:2 FGF2-FGFR1c-HS, el HS interactúa simultáneamente con los sitios de unión al HS de FGF y FGFR paracrinos, lo que refuerza la proximidad FGF-FGFR. Al hacerlo, HS (1) mejora la afinidad de unión de FG-FGFR 1:1; y (2) fortalece las interacciones entre dos complejos 1:1 para dar lugar a dímeros 2:2 doblemente simétricos26. La dimerización de FGFR extracelular promueve la formación de un complejo asimétrico termodinámicamente débil de los dominios de cinasa intracelulares27 que median la transfosforilación de tirosina del bucle (A) y, por lo tanto, la activación de la cinasa y la señalización intracelular.

Los sitios de unión a HS de las hormonas FGF difieren tanto en su composición como en su conformación de los de los FGF paracrinos, lo que debilita drásticamente su afinidad por HS28. En consecuencia, las hormonas FGF evitan que las HSPG las atrapen en la matriz extracelular y pueden entrar en la circulación. Además, las hormonas FGF tienen una afinidad débil por los FGFR28,29 debido a las sustituciones de sus residuos de unión al receptor clave. Si bien estas idiosincrasias estructurales y bioquímicas confieren un modo de acción hormonal, hacen que el HS sea insuficiente para que el FGF endocrino se una al FGFR e induzca la dimerización del receptor. De hecho, para compensar estas deficiencias, las hormonas FGF han desarrollado una dependencia absoluta de αKlotho o βKlotho como un correceptor adicional para la señalización. α- y βKlotho son proteínas transmembrana de un solo paso con un gran dominio extracelular que comprende dos dominios similares a glucosidasa en tándem (KL1 y KL2) y un dominio intracelular corto3,5. El correceptor αKlotho (o βKlotho) se une simultáneamente a la hormona FGF y su FGFR afín, lo que refuerza la unión del FGF endocrino al FGFR. Los correceptores de Klotho tienen especificidades únicas de unión a la hormona FGF y al FGFR que, en última instancia, dictan la especificidad de unión al FGFR y la selectividad de los FGF endocrinos al tejido/órgano diana. αKlotho se une exclusivamente a FGF23 (ref. 30) mientras que βKlotho se une tanto a FGF19 como a FGF21 (refs. 31, 32, 33, 34). Con respecto a la interacción de FGFR, αKlotho y βKlotho muestran una especificidad compartida por FGFR1c y FGFR4, pero ninguno reconoce las isoformas de empalme 'b' de FGFR1–3. Sin embargo, muestran una especificidad opuesta hacia FGFR2c y FGFR3c con αKlotho que se une a FGFR3c pero no a FGFR2c, mientras que βKlotho se une a FGFR2c pero no a FGFR3c (ref. 35).

El mecanismo del correceptor de αKlotho en la señalización de FGF23 fue iluminado por la estructura cristalina de un complejo ternario que comprende FGF23, el dominio de unión al ligando de FGFR1c6 y el ectodominio soluble de αKlotho (una isoforma natural producida mediante el desprendimiento de la forma transmembrana)36,37. En la estructura, el lazo largo α1β1 (denominado brazo de unión al receptor (RBA)) se extiende desde el dominio KL2 de αKlotho y cierra un surco hidrofóbico en el dominio D3 de FGFR (un sello conservado de FGFR1c–3c y FGFR4), mientras que un gran la hendidura en la unión entre KL1 y KL2 abraza la cola C larga de FGF23. Al hacerlo, αKlotho refuerza la proximidad FGF23-FGFR y la estabilidad compleja. En cuanto al papel de HS, anteriormente postulamos que HS permite que dos complejos 1:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho se ensamblen en una unidad de señalización cuaternaria simétrica 2:2:2:2 FGF23–FGFR–αKlotho–HS que recuerda a 2 :2:2 dímeros paracrinos FGF–FGFR–HS6. Para establecer el mecanismo subyacente a la dimerización/activación del FGFR dependiente del correceptor dual (es decir, αKlotho y HS) por las hormonas FGF, resolvimos las estructuras de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) de los tres complejos cuaternarios FGF23-FGFR-αKlotho-HS fisiológicamente posibles. Inesperadamente, estas estructuras, respaldadas por datos integrales basados ​​en células, revelan que HS fortalece las interacciones de FGF23 y su FGFR primario dentro de un FGF23–FGFR–αKlotho 1: 1: 1 con un FGFR solitario secundario, lo que induce la activación y dimerización asimétrica del receptor. En particular, el modo asimétrico de dimerización del receptor es generalizable a los FGF paracrinos, lo que anula nuestro modelo simétrico actual para la dimerización y activación de FGFR26.

Preparamos mezclas cuaternarias 1: 1: 1: 1 de FGF23 humano maduro de longitud completa, las porciones de unión al ligando extracelular (es decir, que abarcan los dominios D2 y D3) de tres FGFR humanos afines de FGF23 (es decir, FGFR1c, FGFR3c y FGFR4), el ectodominio completo del correceptor αKlotho humano y un dodecasacárido de heparina completamente sulfatado (en adelante, denominado HS). Los tres complejos cuaternarios resultantes (es decir, FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS y FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) se aislaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y se usaron directamente para la vitrificación. Recopilación de imágenes crio-EM y determinación de la estructura (datos extendidos Fig. 1, tabla de datos extendidos 1 y figura complementaria 2). Contrariamente a nuestra predicción, las tres estructuras crio-EM revelan ensamblajes cuaternarios 1:2:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS asimétricos idénticos en los que HS permite que un complejo ternario 1:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho reclute un cadena de FGFR solitaria (denominada FGFRS para diferenciarla del receptor 'primario' FGFRP dentro del complejo ternario) (Fig. 1). En el extremo distal de la membrana de cada complejo cuaternario, HS participa en interacciones tripartitas con sitios de unión de HS yuxtapuestos de FGF23, FGFRP y FGFRS (Fig. 2a). Al hacerlo, HS aumenta las interacciones de FGF23 y FGFRP del complejo ternario FGF23-FGFRP-αKlotho con la cadena FGFRS y, por lo tanto, induce la dimerización del receptor (es decir, FGFRP-FGFRS) (Fig. 3a). En particular, la proximidad y la orientación (perpendicular a la membrana plasmática) de los extremos C-terminales de las cadenas FGFR (aproximadamente 25 Å de distancia) consienten con la formación de un dímero asimétrico transfosforilador de bucle A del dominio de quinasa intracelular27 (Datos extendidos Fig. 2a). Aunque αKlotho no interactúa directamente con FGFRS, preside el reclutamiento de FGFRS al estabilizar el complejo FGF23-FGFRP. Sin la ayuda de αKlotho, HS no puede generar de forma independiente un complejo FGF23-FGFRP estable que es necesario para reclutar un FGFRS secundario. De hecho, los experimentos basados ​​en células confirman que la señalización de FGF23 depende estrictamente de αKlotho (datos extendidos, figura 2b). La conformación del complejo ternario FGF23–FGFRP–αKlotho dentro de los ensamblajes cuaternarios 1:2:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS es similar a la de la estructura de rayos X del complejo ternario FGF23–FGFR–αKlotho libre de HS (desviación cuadrática media raíz (RMSD) de solo 1,16 Å, datos extendidos Fig. 2c)6. Sin embargo, el componente FGFRS del complejo cuaternario adopta una conformación distorsionada que es incompatible con la unión del ligando, lo que explica la asimetría distinta del complejo cuaternario (Fig. 4 complementaria).

Vista general de las reconstrucciones crio-EM de los complejos cuaternarios FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (a), FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (b) y FGF23–FGFR4–αKlotho–HS (c) que se muestran en niveles de umbral de 0,6, 0,45 y 0,5, respectivamente. El complejo cuaternario se muestra en dos orientaciones diferentes relacionadas por una rotación de 180° a lo largo del eje vertical. FGF23 está coloreado en naranja, αKlotho se muestra en azul profundo y HS está en magenta. El receptor primario (FGFRP) y el receptor secundario (FGFRS) se muestran en verde y azul claro en el complejo FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, en tostado y rosa en el complejo FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS y en dorado y amarillo claro en el complejo FGF23–FGFR4–αKlotho–HS. Se marcan dos dominios similares a glucosidasa en tándem (KL1 y KL2) y RBA de αKlotho. La relevancia de la densidad extra débil (en gris) que se ve en los tres complejos cuaternarios 1: 2: 1: 1 se analiza en la Fig. 3 complementaria.

a, complejo cuaternario asimétrico FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS mostrado como un híbrido de dibujos animados (FGF23, FGFR y HS) y superficie (αKlotho) en la misma orientación que en la Fig. 1a (izquierda). b, Vista ampliada de la región encuadrada en el panel a que muestra la interacción tripartita de HS con FGF23, FGFRP y FGFRS. Los residuos que interactúan con HS se muestran como barras y están etiquetados. Los enlaces de hidrógeno en esta figura y las figuras subsiguientes se representan como líneas discontinuas negras. A lo largo de las figuras, los átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre están coloreados de azul, rojo y amarillo, respectivamente. Todas las ilustraciones estructurales se realizaron utilizando Pymol (v.2.5.2). c, L6-FGFR1cWT, L6-FGFR1cΔHBS1, L6-FGFR1cΔHBS1 o L6-FGFR1cΔHBS1+2 se cotrataron con una mezcla 20 nM 1:1 de FGF23WT + αKlotho o FGF23R48A/R140A (FGF23ΔHBS) + αKlotho (en el caso de L6-F Solo GFR1cWT ) o no se trata. Los lisados ​​​​celulares totales se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo anti-pY656/Y657-FGFR, anti-pY783-PLCγ1, anti-pY196-FRS2α, anti-pT202/Y204-ERK y anti-β-tubulina (control de carga). d, Pérdida en las capacidades de los mutantes FGF23ΔHBS y FGFR1cΔHBS para inducir la formación del complejo cuaternario FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS como se visualiza por PLA. Las manchas rojas significan complejos cuaternarios FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS en la superficie celular y los círculos/óvalos grandes teñidos de azul son núcleos celulares. Tenga en cuenta que, en comparación con las células L6-FGFR1cWT tratadas con FGF23WT, hay muchas menos manchas rojas en las células L6-FGFRcWT tratadas con FGF23ΔHBS y L6-FGFR1cΔHBS tratadas con FGF23WT. Barra de escala, 10 μm. La inmunotransferencia (c, normalizada contra FGFR1 y FGF23 de tipo salvaje, n = 3 experimentos biológicamente independientes) y PLA (d, n = 6 campos de microscopio elegidos al azar de dos experimentos biológicamente independientes) se cuantificaron como se describe en la sección Métodos y se presentan como la media ± desviación estándar. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey.

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a, Representación de la estructura compleja FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS como una mezcla de caricatura (FGF23 y FGFR) y superficie (αKlotho). La vista está relacionada con la de la Fig. 1a (derecha) mediante una rotación de 90° a lo largo del eje vertical. Los sitios de contacto 1 y 2 de la interfaz del dímero FGFR1cP–FGFR1cS están recuadrados en azul y negro, respectivamente. Tenga en cuenta que αKlotho no participa directamente en el reclutamiento de FGFR1S. Izquierda, vista ampliada del sitio 1 que involucra el dominio D2 de FGFR1cP y D2, conector D2-D3 y D3 de FGFR1cS. Derecha, vista de primer plano del sitio 2 entre los dominios D3 de FGFR1cP y FGFR1cS. Las cadenas laterales de los residuos que interactúan se muestran como barras. Los elementos de la estructura secundaria seleccionados están etiquetados. Los contactos hidrofóbicos se destacan como una superficie semitransparente. Un ion Cu2+ (esfera naranja) está coordinado por residuos de histidina análogos de FGFR1cP y FGFR1cS. La asignación de Cu2+ se basó en una publicación anterior que implicaba interacciones específicas de Cu2+ con dominios extracelulares de FGFRs39. Los iones Cu2+ probablemente se derivan de los medios de cultivo celular (DMEM y DME/F12) utilizados para cultivar células HEK293S GnTI− que secretan ectodominios FGFR mínimamente glicosilados. b – d, análisis de inmunotransferencia de extractos de células enteras sondeados como en la Fig. 2c de líneas celulares L6 expresadas con FGFR1c (b), FGFR3c (c) o FGFR4 (d) no estimulado o FGF23 (20 nM) y αKlotho (20 nM). Los datos de inmunotransferencia se cuantificaron como se describe en la sección Métodos y se presentan como la media ± desviación estándar. Datos normalizados contra FGFR y FGF23 de tipo salvaje, n = 3 experimentos biológicamente independientes. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey.

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Las interacciones FGF23-HS están mediadas por tres residuos (Arg48, Arg140 y Tyr154) del sitio de unión atípico de HS dentro del núcleo de FGF23 (Fig. 2b). En comparación con los contactos FGF23-HS, HS interactúa más ampliamente con HBS en los dominios D2 de las dos cadenas de FGFR, lo que involucra los residuos Lys177, Lys207, Arg209 y Ser214 de FGFR1cP y Lys175, Lys177, Val208, Arg209 y Thr212 de FGFR1cS (Fig. 2b ). Para validar la importancia fisiológica de las interacciones triples de HS con FGF23, FGFR1cP y FGFR1cS para la inducción de la dimerización del receptor (es decir, FGFRP-FGFRS), introdujimos una doble mutación R48A/R140A en FGF23 (FGF23ΔHBS) y K175Q/K177Q y mutaciones dobles K207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS1 y FGFR1cΔHBS2) por separado o en combinación (K175Q/K177Q/K207Q/R209Q denominadas FGFR1cΔHBS1+2) en el FGFR1c completo. El FGFR1c de tipo salvaje (FGFR1cWT) y sus variantes mutadas se expresaron de manera estable en la superficie de células de mioblastos esqueléticos de rata (L6), una línea celular deficiente en αKlotho y FGFR. El tratamiento con endoglicosidasa H (Endo H) y péptido:N-glucosidasa F (PNGasa F) de lisados ​​celulares seguido de análisis de inmunotransferencia con anticuerpos específicos de FGFR mostró que las variantes de FGFR1c mutadas contienen azúcares complejos, lo que implica que residen en la superficie celular (extensión ampliada). Datos Fig. 3a). La misma homogeneidad/cantidad de muestras de FGF23WT y FGF23ΔHBS se verificó mediante SDS-PAGE (Fig. 2d complementaria). El cotratamiento con FGF23WT y αKlotho soluble de L6-FGFR1cWT condujo a una activación/señalización sólida de FGFR1c, medida por la fosforilación de FGFR1c en tirosinas del bucle A, sus dos sustratos directos PLCγ1 (en el regulador Y783) y FRS2α (en el sitio de reclutamiento de Grb2 Y196) y la activación subsiguiente de una vía de proteína quinasa activada por mitógeno RAS (MAPK) monitoreada por la fosforilación de quinasa regulada por señal extracelular (ERK) en T202/Y204. Por el contrario, los mutantes dobles FGFR1cΔHBS1 y FGFR1cΔHBS2 sufrieron pérdidas importantes en su capacidad para inducir la señalización de FGF23, y el mutante cuádruple FGFR1cΔHBS1+2 se volvió totalmente silencioso (Fig. 2c). Asimismo, FGF23ΔHBS se retrasó significativamente en su capacidad para activar L6-FGFR1cWT en presencia de αKlotho soluble. Los datos de activación/señalización de FGFR se reflejaron en los datos del ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Específicamente, el cotratamiento con FGF23WT y αKlotho condujo a la aparición de abundantes e intensas señales fluorescentes punteadas en la superficie de la línea celular L6-FGFR1cWT. Por el contrario, había muchas menos señales fluorescentes en la superficie de las líneas celulares FGFR1cΔHBS1, FGFR1cΔHBS2 y FGFR1cΔHBS1+2 tras el cotratamiento. De manera similar, hubo una cantidad notablemente menor de puntos fluorescentes en la superficie de la línea celular L6-FGFR1cWT cuando se cotrató con FGF23ΔHBS y αKlotho soluble (Fig. 2d). Estos datos basados ​​en células confirman la indispensabilidad de los contactos FGF23–HS y FGFR1c–HS para inducir la formación de un complejo de señalización de superficie celular cuaternario FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS. De acuerdo con la estequiometría 1: 2: 1: 1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS en las estructuras crio-EM, los experimentos de dispersión de luz multiángulo de cromatografía de exclusión por tamaño mostraron que el complejo cuaternario FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS migra como una sola especie con una masa molecular calculada de aproximadamente 220 kDa, que coincide estrechamente con el valor teórico para un FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS 1: 2: 1: 1 (215 kDa) (Fig. 2e complementaria).

Los tres subdominios (es decir, D2, conector D2-D3 y D3) de las cadenas FGFRP y FGFRS participan en el reclutamiento de FGFRS al complejo ternario y, por lo tanto, en la promoción de la dimerización del receptor (Fig. 3a). Los contactos directos FGFRP-FGFRS entierran un área de superficie expuesta al solvente modesta (1542.6 Å2) y se conservan entre las tres estructuras crio-EM. La interfaz FGFRP-FGFRS se puede dividir en dos sitios (es decir, los sitios 1 y 2). En el sitio 1, los residuos de las regiones de bucle discontinuo (es decir, bucles βA'–βB y βE–βF) en la esquina inferior (C-terminal) de D2 de FGFRP se empaquetan asimétricamente contra D2, el conector D2–D3 y D3 de FGFRS (Figura 3a). En el sitio 2, un tramo contiguo de residuos que abarcan el enlazador D2-D3, la hebra βA, el bucle βA-βA' y la hebra βB' de D3, se acoplan a la región correspondiente del receptor secundario de forma pseudosimétrica (Fig. 3a y Suplementario). Tabla 1). En particular, la interfaz FGFRP-FGFRS atrapa dos residuos cruciales de unión a ligandos de FGFRS, a saber, Arg250 y Ser346, lo que priva aún más a FGFRS de la unión de ligandos (Fig. 4b complementaria).

Nos dirigimos al sitio 2 de la interfaz FGFRP-FGFRS en cada uno de los tres complejos cuaternarios mediante la introducción de cuatro mutaciones puntuales diferentes individualmente en FGFR1c de longitud completa (E249A, R254A, I256A, Y280A), FGFR3c (E247A, R252A, I254A, Y278A) o FGFR4 (E243A, R248A, I250A, Y274A). Además, introdujimos una triple mutación A170D/A171D/S219K en FGFR1c en el sitio objetivo 1 de la interfaz del dímero FGFR1cP-FGFR1cS (Fig. 3a) como representante de los tres complejos cuaternarios. Las variantes de FGFR1c, FGFR3c y FGFR4 de longitud completa junto con sus contrapartes de tipo salvaje se expresaron de manera estable en células L6. Como se mencionó anteriormente, se utilizó la sensibilidad de Endo H para garantizar que las mutaciones no afecten la glicosilación/maduración del receptor y la presentación de la superficie celular (Datos extendidos Fig. 3b-d). Aparte del FGFR1cI256A y su correspondiente mutante FGFR4I250A, todos los mutantes mostraron proporciones comparables de FGFR resistentes a Endo H frente a FGFR de tipo salvaje similares a proteínas FGFR totales. Estos datos implican que solo FGFR1cI256A y el FGFR4I250A correspondiente tenían expresión reducida en la superficie celular. Como en el caso de la línea celular L6-FGFR1cWT, el cotratamiento con FGF23 y αKlotho soluble de las líneas celulares L6-FGFR3cWT y L6-FGFR4WT estimuló fuertemente la señalización de FGFR detectada por fosforilación/activación de FGFR y transductores de señal PLCγ1/FRS2α/ERK aguas abajo. Por el contrario, las células que expresaban FGFR1c, FGFR3c y FGFR4 mutados habían disminuido la fosforilación de tirosina del bucle A de FGFR y reducido la activación de PLCγ1, FRS2α y MAPK (Fig. 3b-d). Es poco probable que la señalización deteriorada por FGFR1cI256A y FGFR4I250A se deba únicamente a la reducción de la expresión en la superficie celular porque la glicosilación y la expresión en la superficie celular del FGFR3cI254A correspondiente no se ven afectadas.

FGF23 también participa en el reclutamiento de FGFRS para el complejo ternario y, por lo tanto, en el refuerzo de la dimerización de FGFRP-FGFRS. Estos contactos secundarios FGF23-FGFRS están mediados tanto por el núcleo de trébol rígido como por el terminal N flexible de FGF23. Específicamente, los bucles β8–β9 y β10–β12 dentro del núcleo del trébol de FGF23 interactúan con los bucles βC–βD y βE–βF en el borde inferior (C-terminal) del dominio FGFRS D2 (Fig. 4a). Paralelamente, los residuos hidrofóbicos en el extremo más distal del extremo FGF23 N se extienden desde el complejo FGF23-FGFRP-αKlotho e interactúan con un surco hidrofóbico en el dominio FGFRS D3 que corresponde al surco D3 en FGFRP acoplado por el RBA de αKlotho ( Fig. 4a y datos extendidos Fig. 4a). Al hacerlo, es probable que el extremo N de FGF23 desaliente la unión de otro αKlotho a FGFRS y, por lo tanto, contribuya a la asimetría del complejo cuaternario. Cuando se compara con la estructura cristalina del complejo 1:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho sin HS, el extremo N de FGF23 muestra un cambio conformacional importante en el cuaternario 1:2:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS complejo (Datos extendidos Fig. 4b-d). En particular, en las tres estructuras crio-EM, las densidades de electrones para el terminal FGF23 N están mal definidas, lo que implica que el terminal FGF23 N se acopla a FGFRS D3 de una manera bastante degenerada y flexible (Fig. 1a-c y Datos extendidos Fig. 4e ). Las interacciones del extremo FGF23 N con FGFRS D3 se corroboraron mediante una simulación de dinámica molecular (MD) de todos los átomos de 300 ns del complejo FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (Datos extendidos Fig. 4f–i). Similar a la interfaz FGFRP-FGFRS, la interfaz FGF23-FGFRS (Tabla complementaria 2) también se conserva entre los tres complejos cuaternarios y enmascara un área expuesta de superficie bastante modesta (1668.6 Å2). En particular, el extremo FGF23 N y D3 del FGFRS se acoplan entre sí en la proximidad del sitio 2 de la interfaz FGFRP-FGFRS (Fig. 4a). Esto implica que los contactos FGF23-FGFRS y FGFRP-FGFRS actúan en conjunto para reclutar FGFRS al complejo ternario y promover la dimerización del receptor (es decir, FGFRP-FGFRS).

a, Representación de dibujos animados de la estructura FGF23–FGFR–αKlotho–HS en la misma vista que en la Fig. 1a (derecha). Los recuadros naranja y negro representan las dos regiones de contacto entre FGF23 y FGFRS, a saber, dominio FGF23core:FGFR1cS D2 (izquierda, recuadro naranja) y dominio FGF23NT:FGFR1cS D3 (derecha). b, las células L6-FGFR1cWT se trataron con concentraciones crecientes de FGF23WT, FGF23ΔNT o FGF23ΔSRBS y los lisados ​​de células enteras se analizaron como en la Fig. 2. Se verificó la homogeneidad/cantidad iguales de las muestras de FGF23WT, FGF23ΔNT y FGF23ΔSRBS mediante SDS-PAGE (Fig. 2d). c, Pérdida en las capacidades de los mutantes FGF23ΔNT y FGF23ΔSRBS para inducir la formación del complejo cuaternario FGF23–FGFR–αKlotho–HS (es decir, dimerización del receptor) en relación con FGF23WT según lo evaluado por PLA. Tenga en cuenta que hay muchas menos manchas rojas en las células estimuladas con mutantes FGF23 en relación con FGF23WT. d, las células L6-FGFR1cWT se trataron con FGF23WT (40 nM) solo, FGF23WT (40 nM) mezclado con FGF23ΔSRBS (40 nM) o FGF23ΔNT (40 nM) y los extractos de células enteras se probaron con anticuerpos pFGFR. Barra de escala, 10 μm. La inmunotransferencia (b y d, n = 3 experimentos biológicamente independientes) y PLA (c, n = 6 campos de microscopio elegidos al azar de dos experimentos biológicamente independientes) se cuantificaron como se describe en la sección Métodos y se presentan como la media ± desviación estándar. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey.

Datos fuente

A continuación, estudiamos el impacto de interferir con los contactos secundarios FGF23-FGFRS en la formación del complejo de señalización cuaternario 1: 2: 1: 1 FGF23-FGFR-αKlotho-HS. Para este propósito, generamos dos variantes de FGF23: una que carece de sus primeros 12 residuos N-terminales (es decir, Y25 a W36; denominada FGF23ΔNT) y la otra que alberga una triple mutación M149A/N150A/P151A dentro de la región central de FGF23. (denominado FGF23ΔSRBS). De acuerdo con las estructuras crio-EM, se predice que la triple mutación M149A/N150A/P151A y el truncamiento N-terminal anularán las interacciones secundarias de FGF23 con los dominios D2 y D3 de FGFRS, respectivamente, y por lo tanto afectarán la señalización de FGF23 (Fig. 4a). Para probar esto, se generó una línea celular L6 que coexpresa FGFR1cWT y αKlotho transmembrana y se expuso a concentraciones crecientes de FGF23WT, FGF23ΔNT o FGF23ΔSRBS. Las eficacias de dimerización / activación del receptor de concentraciones crecientes de ligandos se evaluaron mediante inmunotransferencia para la fosforilación de tirosina del bucle A de FGFR y mediante PLA (Fig. 4b, c). La comparación de las curvas de dosis-respuesta mostró que, en todas las concentraciones, ni FGF23ΔNT ni FGF23ΔSRBS pudieron alcanzar la actividad máxima (Emax) ejercida por FGF23WT en ambos ensayos. Además, cuando se combinaron con FGF23WT, tanto FGF23ΔSRBS como FGF23ΔNT actuaron como antagonistas competitivos que produjeron una disminución neta en la activación de FGFR1c (Fig. 4d). Sin embargo, en relación con FGF23ΔNT, FGF23ΔSRBS mostró una mayor pérdida en su capacidad de dimerización/señalización (Fig. 4b-d), lo que implica que los contactos FGF23-FGFRS mediados a través del núcleo de FGF23 contribuyen más a la estabilidad y funcionalidad general del FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS complejo de señalización cuaternario que los mediados por el extremo N de FGF23.

Ideamos un ensayo de complementación de receptores basado en células para interrogar la asimetría de los complejos de señalización cuaternaria FGF23–FGFR–αKlotho–HS. Específicamente, en función de los distintos roles que desempeñan los receptores primarios y secundarios en la dimerización asimétrica, diseñamos dos variantes de FGFR1c capaces de actuar exclusivamente como receptor primario o secundario. Razonamos que aunque estas variantes serían disfuncionales individualmente, deberían complementarse entre sí y formar un complejo cuaternario funcional 1: 2: 1: 1 en respuesta a FGF 23 y αKlotho (Fig. 5a y Extended Data Fig. 5a, b). Para generar una variante de FGFR1c que funcione exclusivamente como receptor primario, introdujimos una doble mutación I203E/S223E en su dominio D2. Como se mencionó anteriormente, estos dos residuos en FGFR1cS participan en contactos hidrofóbicos y de enlaces de hidrógeno con residuos en el núcleo de FGF23 (es decir, interfaz FGF23-FGFR1cS, Fig. 4a), que son indispensables para el reclutamiento de FGFR1cS al complejo ternario como implicado por la grave pérdida de función de FGF23ΔSRBS (Fig. 4b, c). Sin embargo, los residuos correspondientes en FGFR1cP son prescindibles para la formación de complejos cuaternarios y están expuestos al solvente (Datos extendidos Fig. 5b). En consecuencia, se predice que el FGFR1c mutante resultante (denominado FGFR1cΔSLBS) perderá la capacidad de actuar como receptor secundario pero debería conservar la capacidad de actuar como receptor primario. Para hacer una variante de FGFR1c capaz de actuar únicamente como receptor secundario, introdujimos una doble mutación A167D/V248D en su dominio D2. La doble mutación A167D/V248D anula la formación de contactos hidrófobos y de hidrógeno altamente conservados entre FGF23 y el dominio FGFR1P D2 (datos extendidos Fig. 5a,b). Por lo tanto, se predice que el mutante FGFR1cA167D/V248D resultante (denominado FGFR1cΔPLBS) perderá la capacidad de funcionar como receptor primario (es decir, formar un complejo ternario). Sin embargo, FGFR1cΔPLBS debería conservar su capacidad para funcionar como un receptor secundario porque los residuos correspondientes en FGFR1cS no juegan ningún papel en la formación del complejo cuaternario y están completamente expuestos al solvente.

a, Diagrama esquemático que muestra que, en respuesta al tratamiento conjunto con FGF23 y αKlotho, FGFR1cΔSLBS y FGFR1cΔPLBS pueden complementarse entre sí y formar un complejo asimétrico 1:1:1:1:1 FGF23–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLB–αKlotho–HS. b, Análisis de inmunotransferencia de extractos completos de líneas celulares L6 no tratadas o cotratadas con FGF23 y αKlotho que expresan individualmente FGFR1cWT, FGFR1cΔPLBS y FGFR1cΔSLBS o coexpresan FGFR1cΔSLBS con FGFR1cΔPLBS sondeadas como en la Fig. 2. c, Diagrama esquemático que muestra que FGF23, αKlotho y FGFR4ΔSLBS (que actúa como receptor primario) forma un complejo ternario y recluta FGFR1cΔPLBS como receptor secundario, en presencia de HS. d, las líneas celulares L6 cotratadas con FGF23 y αKlotho que expresan de forma estable FGFR4WT, FGFR4ΔSLBS solo o FGFR4ΔSLBS junto con FGFR1cΔPLBS se analizaron para determinar la activación/señalización de FGFR utilizando transferencia Western de lisados ​​celulares totales como en la Fig. 2. e, Diagrama esquemático que muestra que, en respuesta a FGF1/4 y HS paracrinos, FGFR1cΔSLBS y FGFR1cΔPLBS pueden complementarse entre sí y formar complejos de señalización asimétrica 1:1:1:1 FGF–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLBS–HS. f, las líneas celulares L6 que expresan FGFR1cΔSLBS y FGFR1cΔPLBS individualmente o coexpresándolas se trataron con FGF1 (1 nM) y los extractos celulares se inmunotransfirieron como en la Fig. 2. g, Diagrama esquemático que muestra que FGF1, HS y FGFR4ΔSLBS (que actúan como receptor primario ) forman un complejo estable que posteriormente recluta FGFR1cΔPLBS como receptor secundario. h, las líneas celulares L6 que expresan FGFR4WT o FGFR4ΔSLBS individualmente o coexpresando FGFR4ΔSLBS con FGFR1cΔPLBS se trataron con FGF1 (1 nM) y los extractos celulares se inmunotransfirieron como en la Fig. 2. Los experimentos se realizaron por triplicado biológico con resultados similares. CT, terminal C; NT, terminal N.

Para realizar el ensayo de complementación, se generó una línea celular L6 que coexpresa FGFR1cΔSLBS y FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS) junto con dos líneas celulares L6 de control que expresan individualmente FGFR1cΔSLBS (L6-FGFR1cΔSLBS) y FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔPLBS). Estas tres líneas celulares y L6-FGFR1cWT (control positivo) se expusieron a una concentración fija de FGF23 y αKlotho soluble durante intervalos de tiempo crecientes. La señalización de FGFR1c se evaluó mediante el control de la fosforilación de tirosina de FGFR, PLCγ1 y FRS2α, y la posterior activación de la vía MAPK. En comparación con la línea celular L6-FGFR1cWT, hubo una señalización de FGFR insignificante en las células L6-FGFR1cΔPLBS o L6-FGFR1cΔSLBS (Fig. 5b), lo que implica que estas variantes por sí solas no pueden formar complejos cuaternarios competentes en señalización. Por el contrario, la coexpresión de FGFR1cΔSLBS con FGFR1cΔPLBS (Fig. 5b) dio como resultado una activación sólida de una vía de señalización de FGFR. Estos datos implican que FGFR1cΔSLBS puede complementar FGFR1cΔPLBS en la formación de un complejo cuaternario FGF23–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLBS–αKlotho–HS competente en señalización, en el que FGFR1cΔSLBS asume el papel de receptor primario mientras que FGFR1cΔPLBS se adopta como receptor secundario (Fig. 5a). La formación de un complejo de señalización asimétrico FGF23–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLBS–αKlotho–HS también fue validada por PLA (Datos extendidos Fig. 5c). En comparación con las células L6-FGFR1cWT, el cotratamiento con FGF23 y αKlotho no generó señales fluorescentes en la superficie de las células L6-FGFR1cΔSLBS y L6-FGFR1cΔPLBS, lo que implica que las variantes FGFR1cΔSLBS y L6-FGFR1cΔPLBS por sí solas no experimentan dimerización del receptor (es decir, dimerización cuaternaria). formación de complejos). Por el contrario, la estimulación de las células de coexpresión de L6-FGFR1CΔSLBS + FGFR1CΔPLBS con FGF23 y αklotho condujo a la apariencia de copiosos e intensos florescentes, lo que implica que FGFR1CΔSLBS y FGFR1CΔPLBS se han complementado y ensamblado en una asimmetric FGF23-FGFR1CFMSHMSHMSHMSHMSHMSHMSHMSL. Klotho– Complejo de señalización HS.

Como se mencionó anteriormente, las interfaces FGFRP-FGFRS y FGF23-FGFRS son casi invariantes entre los tres complejos cuaternarios. Esta observación nos brindó otra oportunidad de interrogar la asimetría del complejo. Específicamente, razonamos que un FGFR1cP primario debería poder emparejarse con FGFR3c o FGFR4 como receptor secundario para producir 1:2:1:1 FGF23–FGFR1c–FGFR3c–αKlotho–HS o FGF23–FGFR1c–FGFR4–αKloth–HS funcional complejos cuaternarios heterodiméricos (Fig. 5c). Para probar esta posibilidad, llevamos a cabo un ensayo de complementación del receptor utilizando una variante de FGFR4 que alberga una doble mutación I197E/S217E (denominada FGFR4ΔSLBS), que corresponde a FGFR1cΔSLBS, como receptor principal y FGFR1cΔPLBS como receptor secundario. Se derivó una línea celular L6 que coexpresa FGFR1cΔPLBS con FGFR4ΔSLBS (L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS), junto con líneas celulares de control que expresan individualmente FGFR4WT (L6-FGFR4WT) y FGFR4ΔSLBS (L6-FGFR4ΔSLBS). Estas líneas celulares se cotrataron con FGF23 más αKlotho, y se examinó la formación del complejo de señalización cuaternario mediante análisis de inmunotransferencia y PLA. Al igual que con FGFR1cΔSLBS y FGFR1cΔPLBS, FGFR4ΔSLBS tampoco se activó en respuesta al cotratamiento con FGF23 más αKlotho. Sin embargo, tuvo lugar una activación robusta de una vía de señalización de FGFR en la línea celular que coexpresa L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS (Fig. 5d). Los datos de señalización celular fueron reflejados por el PLA (Datos extendidos Fig. 5c). Específicamente, la señal fluorescente intrascendente estaba presente en la superficie de la línea celular L6-FGFR4ΔSLBS tras la coestimulación con FGF23 y αKlotho. Por el contrario, aparecieron abundantes e intensas manchas fluorescentes punteadas en la superficie de las células que coexpresaban L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS, lo que implica que se puede formar un complejo cuaternario heterodimérico FGF23–FGFR1c–FGFR4–αKlotho–HS en la superficie de las células vivas. Estos datos de complementación y heterodimerización del receptor basados ​​en células confirman inequívocamente la asimetría de nuestro complejo de transducción de señales 1:2:1:1 FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS deducido estructuralmente.

Debido a que el correceptor αKlotho no participa directamente en el reclutamiento de FGFRS, sugerimos que el modo asimétrico de dimerización del receptor revelado por nuestras estructuras crio-EM FGF23-FGFR-αKlotho-HS también puede ser relevante para los FGF paracrinos. Para probar esta conjetura, estudiamos los impactos de las mutaciones asimétricas de la interfaz del dímero FGFRP-FGFRS en las capacidades de FGFR1c y FGFR2b para mediar en la señalización de FGF paracrino. Estas dos isoformas de FGFR se eligieron debido a su perfil de especificidad/promiscuidad de unión a ligando único y superpuesto (Datos ampliados, Fig. 5d). FGFR1c responde a FGF1 paracrino (un ligando pan-FGFR) y FGF4, mientras que FGFR2b media las acciones de FGF1, FGF3, FGF7, FGF10 y FGF22. Para los estudios de FGFR2b, generamos líneas celulares L6 que expresan mutantes de tipo salvaje (FGFR2bWT) o FGFR2b (es decir, FGFR2bE250A, FGFR2bR255A, FGFR2bI257A y FGFR2bY281A) análogos a los mutantes FGFR1c mencionados anteriormente. Tanto los mutantes FGFR1c como FGFR2b se vieron afectados en su capacidad para someterse a la autofosforilación de tirosina trans inducida por ligando, que también fue recíproca en la fosforilación reducida de PLCγ1 y FRS2α (Datos extendidos Fig. 6).

A continuación, llevamos a cabo ensayos de complementación de receptores y heterodimerización como se hizo para FGF23. Para el estudio de complementación de FGFR2b, establecimos las líneas celulares L6-FGFR2bΔSLBS, L6-FGFR2bΔPLBS y L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS correspondientes a las líneas celulares FGFR1c utilizadas para el estudio FGF23. En respuesta a la estimulación con FGF1 o FGF4, las células que expresan FGFR1cΔPLBS o FGFR1cΔSLBS solo no lograron provocar ninguna señalización apreciable de FGFR1c, mientras que las células L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS respondieron con una sólida activación y señalización de FGFR1c (Fig. 5e, f). Del mismo modo, FGF1, FGF3, FGF7 y FGF10 indujeron cada uno la activación y señalización de FGFR solo en los coexpresores L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS (datos extendidos, Fig. 7). Por último, estudiamos la posibilidad de heterodimerización de FGFR por FGF paracrinos centrándonos en: (1) heterodimerizaciones de FGFR1c-FGFR4 y FGFR1b-FGFR2b por FGF1; (2) heterodimerización de FGFR1b-FGFR2b por FGF10; y (3) heterodimerización de FGFR2b-FGFR3b por FGF3. Para el ensayo de heterodimerización FGFR1b-FGFR2b, generamos una línea celular L6 que expresa FGFR1bΔSLBS, equivalente a FGFR2bΔSLBS. Para la heterodimerización de FGF2b-FGFR3b por FGF3, usamos FGFR3b de tipo salvaje (FGFR3bWT) como el equivalente de ΔPLBS porque esta isoforma naturalmente no responde a FGF3. FGF1 no pudo activar la señalización de FGFR en las líneas celulares FGFR1cΔPLBS y FGFR4ΔSLBS. Sin embargo, se observó una fuerte señalización de FGFR en la línea celular que coexpresa FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS en respuesta a la estimulación de FGF1 (Fig. 5g, h). Del mismo modo, tanto FGF1 como FGF10 indujeron una activación/señalización sólida de FGFR solo en la línea celular que coexpresa FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS, pero no en las líneas celulares L6-FGFR1bΔSLBS y L6-FGFR2bΔPLBS (datos extendidos Fig. 8a-c). Por último, FGF3 provocó la señalización en la línea celular que coexpresa FGFR2bΔSLBS + FGFR3bWT, pero no en las células L6-FGFR2bΔSLBS y L6-FGFR3bWT (datos extendidos Fig. 8d, e). Con base en estos extensos datos basados ​​en células, concluimos que la señalización de FGF paracrino está mediada a través de dímeros FGF-FGFR 1: 2 asimétricos inducidos por HS, que recuerdan el dímero endocrino 1: 2 FGF23-FGFR inducido por HS y Klotho (Fig. . 9).

Las estructuras del complejo cuaternario asimétrico 1:2:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS y los datos bioquímicos de respaldo presentados en este manuscrito revelan cómo los correceptores de glicosaminoglicanos Klotho y HS actúan en concierto para promover la dimerización asimétrica 1:2 endocrina FGF–FGFR necesaria para activación del receptor y, por lo tanto, señalización de la hormona FGF. En este modelo, los correceptores de Klotho unen la hormona FGF y su receptor principal y, por lo tanto, generan un complejo endocrino FGF-FGFRP estable en el contexto de los complejos ternarios 1:1:1 FGF-FGFRP-Klotho. Al hacerlo, los correceptores de Klotho compensan eficazmente la incompetencia del HS para estabilizar el complejo endocrino FGF-FGFRP (Datos ampliados, Fig. 9). El complejo endocrino estabilizado FGF-FGFRP luego es asistido por un correceptor HS para reclutar un FGFRS secundario. Es importante destacar que la dependencia del correceptor de Klotho restringe el sitio de acción de las hormonas FGF a los tejidos/órganos que expresan Klotho (es decir, riñón y glándulas paratiroides en el caso de FGF23). De acuerdo con la falta de un papel directo de Klotho en el reclutamiento de FGFRS, mostramos que el modo asimétrico de dimerización del receptor también es aplicable a los FGF paracrinos. A diferencia de las hormonas FGF, los FGF paracrinos tienen una afinidad sustancial por HS y, por lo tanto, pueden depender únicamente de HS como un correceptor obligatorio tanto para unirse de manera estable a FGFRP como para reclutar FGFRS. A pesar de compartir similitudes estructurales, Klotho y los dímeros FGF-FGFR 1:2 endocrinos inducidos por HS son termodinámicamente inferiores a los dímeros FGF-FGFR paracrinos 1:2 inducidos por HS. Específicamente, debido a la débil afinidad de unión al HS de la hormona FGF, FGFRS se une con menos fuerza en el dímero endocrino 1:2 FGF-FGFR, lo que explica la menor activación del receptor/capacidad de señalización de las hormonas FGF en relación con los FGF paracrinos, como se postula por nuestro 'modelo de umbral' para la especificidad de señalización de FGF38. Sorprendentemente, el modelo de dimerización asimétrica del receptor es compatible con la heterodimerización del receptor, que probablemente sirva como un mecanismo adicional para afinar cualitativa y cuantitativamente la señalización de FGF.

El kit de clonación In-Fusion HD independiente de la ligadura (n.º 639648, Clontech) se utilizó para construir vectores lentivirales pEF1α-IRES-neo y pEF1α-IRES-hygro resistentes a neomicina e higromicina que codifican FGFR2c, FGFR3c y FGFR3c humanos de longitud completa de tipo salvaje. FGFR4 de acuerdo con el protocolo descrito previamente para el construct6 de expresión lentiviral de FGFR1c humano. La construcción de expresión bacteriana basada en pET-30a para FGF23 humano marcado con his N-terminal (residuos Tyr25 a Ile251) se describió previamente6. Los vectores de expresión pHLsec que codifican la región de unión al ligando extracelular (es decir, la región D2-D3) de FGFR3c (residuos Asp142 a Arg365; FGFR3cecto) y FGFR4 (residuos Asp142 a Arg365; FGFR4ecto) se crearon siguiendo la misma estrategia descrita anteriormente para humanos. FGFR1cecto (ref. 6). Se introdujeron truncamientos y mutaciones de sitio único y múltiple en construcciones de expresión que codifican las proteínas de tipo salvaje utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (n.º E0554S, New England Biolabs Inc.). Las construcciones de expresión se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación de ADN.

Para producir ectodominios mínimamente glicosilados de FGFR1c, 3c y 4, se transfectaron transitoriamente células HEK293S deficientes en N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI-) con las respectivas construcciones de expresión de pHLsec a través del polímero catiónico polietilenimina (PEI, n.º 23966-1, Polysciences, Inc.) siguiendo un protocolo publicado40. Luego, 24 h después de la transfección, se añadió al medio triptona N1 (TN1, nº de catálogo 19553, Organotechnie) para promover la expresión de la proteína. En el tercer día, los ectodominios de FGFR secretados de 1 l de medio acondicionado se capturaron en una columna HiTrap con afinidad de heparina (n.º 17040703, GE Healthcare) y se eluyeron con 20 volúmenes de columna de gradiente de sal (0–2 M). Las fracciones que contenían proteínas FGFRecto se agruparon, se concentraron a 5 ml y se aplicaron a una columna de filtración en gel Superdex-75 (nº 28989333, GE Healthcare). Las proteínas FGFRecto se eluyeron isocráticamente en tampón HEPES 25 mM pH = 7,5 que contenía NaCl 1 M. Las proteínas FGF23 de tipo salvaje y mutadas se expresaron en E. coli como cuerpos de inclusión, se replegaron in vitro y se purificaron hasta la homogeneidad utilizando intercambio catiónico secuencial y SEC siguiendo un protocolo establecido6. El αKlothoecto secretado se purificó a partir de medios acondicionados de una línea celular HEK293S GnTI− que expresa de manera estable todo el dominio extracelular de αKlotho humano (residuos Met1 a Ser981; αKlothoecto) utilizando una columna HiTrap con afinidad de heparina seguida de cromatografía en columna SOUCRE Q anion y Superdex 200, como se describe anteriormente6.

Los complejos cuaternarios FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS o FGF23–FGFR4–αKlotho–HS se prepararon mezclando FGF23 con uno de los ectodominios de FGFR, αKlothoecto y un dodecasacárido de heparina 12 (HO12, Iduron Ltd) usando una relación molar 1:1:1:1. Las mezclas se concentraron a aproximadamente 5 mg ml-1, se aplicaron a una columna Superdex 200 (n.º 28989335, GE Healthcare) y se eluyeron isocráticamente en tampón HEPES 25 mM pH = 7,5 que contenía NaCl 100 mM. Las fracciones máximas se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones superiores que contenían la mayor concentración y pureza del complejo cuaternario se usaron directamente para la preparación de la cuadrícula sin concentración adicional para evitar la agregación de proteínas. Las concentraciones finales de los complejos FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS y FGF23–FGFR4–αKlotho–HS para la preparación de la rejilla fueron 1,5, 2,4 y 1,5 mg ml−1, respectivamente.

Para preparar las rejillas crio-EM, se aplicaron de 2 a 3 μl de complejo de proteína purificada a aproximadamente 1,5 a 2,5 mg ml-1 a ​​la rejilla de oro descargada incandescente (UltrAuFoil). Luego, la rejilla se secó durante 1 a 2 s bajo 0 o 1 fuerza al 100% de humedad usando un Mark IV Vitrobot (FEI) antes de sumergirla en etano líquido. Las micrografías de los complejos FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS y FGF23–FGFR4–αKlotho–HS se adquirieron en un microscopio Talos Arctica con detector de electrones directo K2 con un aumento de ×36 000 (correspondiente a 1,096 Å por píxel). Las dosis acumuladas utilizadas fueron 50,37 e−/Å2 y 53,84 e−/Å2 para FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS y FGF23–FGFR4–αKlotho–HS, respectivamente. Las micrografías del complejo FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS se recolectaron en un microscopio Titan Krios equipado con un detector de electrones directos K2 y un filtro de energía. El aumento utilizado fue de ×130.000, con un tamaño de píxel de 1,048 Å y una dosis acumulada de 72,44 e–/Å2. Se utilizó Leginon41 para apuntar a los agujeros con un espesor de hielo de 5 a 100 nm, lo que resultó en la recolección de 10 186, 6 409 y 16 602 micrografías para cada uno de los tres complejos cuaternarios.

WARP42 se utilizó para la corrección de movimiento y la estimación de la función de transferencia de contraste para los tres conjuntos de datos crio-EM. Se excluyeron las micrografías con una resolución general inferior a 5,5 Å. El número final de micrografías utilizadas fueron 9501, 5164 y 15049, respectivamente, arrojando más de un millón de partículas para cada complejo. A continuación, las pilas de partículas se importaron a cryoSPARC43 para la clasificación bidimensional, la reconstrucción ab-initio con tres o cuatro modelos y la clasificación tridimensional. Finalmente, se utilizaron 1 497 967 (FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS), 291 540 (FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS) y 856 877 (FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) partículas para el refinamiento heterogéneo con simetría C1, lo que resultó en 2.74, 3.20 y Resoluciones de 3,03 Å, respectivamente. Los componentes/dominios de las estructuras de rayos X FGF23–FGFR1c–αKlotho (PDB: 5W21) se acoplaron manualmente en mapas de densidad crio-EM utilizando Chimera44 y se refinó el cuerpo rígido. Luego, los modelos iniciales se ajustaron en Coot45 y se refinaron en el espacio real en Phenix46. Las estadísticas de refinamiento y modelo se muestran en la Tabla de datos ampliados 1. Las imágenes crio-EM representativas, los promedios de clases bidimensionales y los mapas tridimensionales de cada complejo cuaternario se muestran en la Figura 1 de datos ampliados.

La estructura crio-EM del complejo cuaternario FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS se solvató en una caja de agua de 16 × 16 × 16 nm3. El servidor CHARMM-GUI se utilizó para generar la configuración, la topología47,48,49,50 y los archivos de parámetros con el campo de fuerza CHARMM36m51. Además de las moléculas de proteína, el sistema de simulación incluía alrededor de 138 073 moléculas de agua, 393 iones de sodio y 393 de cloruro (imitando el NaCl 150 mM presente en el tampón de proteína), lo que da como resultado un total de 439 298 átomos. Se generó una trayectoria de simulación MD de todos los átomos de 300 ns usando GROMACS 2021 (ref. 52) a 303 K usando un paso de tiempo de 2 fs. La condición límite periódica cúbica se utilizó durante las simulaciones y la interacción de van der Waals se desactivó de 1 nm a 1,2 nm. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon utilizando el método Ewald (PME) de malla de partículas. La minimización de energía se llevó a cabo utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado, seguido de una simulación de equilibrio de número de partículas, volumen y temperatura constantes (NVT) de 0,4 ns y una simulación de equilibrio de número de partículas, presión y temperatura (NPT) constantes de 20 ns mediante la disminución gradual de las restricciones de fuerza desde 1000 kJ mol-1 nm-2 a 400 kJ mol-1 nm-2 (para la etapa NVT) y 400 kJ mol-1 nm-2 a 40 kJ mol-1 nm-2 (para la etapa NPT). Al finalizar los pasos de equilibrio, se eliminaron todas las restricciones de fuerza y ​​se realizó la simulación MD en el conjunto NPT.

Se usaron células HEK293T (verificadas mediante una verificación de morfología bajo el microscopio, micoplasma negativo en 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)) para el empaquetamiento del vector lentiviral y la producción de partículas virales de alto título. Se usó una línea celular de mioblastos L6 (n.º GNR 4, Colección Nacional de Cultivos Celulares Autenticados) como huésped para la expresión estable de FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 humanos de longitud completa (transmembrana) y mutantes de los mismos. Las células L6 expresan endógenamente HSPG, pero carecen de FGFR y del correceptor αKlotho y, por lo tanto, naturalmente no responden a FGF23. Sin embargo, a través de la coexpresión ectópica controlada de FGFR afines y αKlotho o la suplementación exógena con αKlothoecto soluble, estas células pueden responder a la estimulación de FGF23. En consecuencia, las células L6 son anfitriones excelentes para los estudios de reconstitución de la señalización de FGF23 en un entorno fisiológico. Tanto las células HEK293T como las L6 se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, n.º C11995500BT, Gibco) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, n.º FSD500, ExCell Bio), 100 U ml−1 de penicilina y 100 μg ml −1 Estreptomicina (nº P1400, Solarbio). El empaquetamiento viral y la generación de partículas de lentivirus recombinantes en células HEK293T se llevaron a cabo utilizando protocolos publicados33. Para la expresión estable de líneas celulares de FGFR de tipo salvaje o mutadas individuales, se sembraron 2 × 105 células L6 en placas de cultivo celular de seis pocillos y se infectaron con partículas de lentivirus que codifican FGFR dado en presencia de polibreno (5 μg ml−1; no. sc-134220, Santa Cruz Biotecnología). Los transfectantes estables se seleccionaron usando G418 (0,5 mg ml-1, n.º HY-17561, MedChemExpress) o higromicina (8 μg ml-1, n.º HY-B0490, MedChemExpress). Para la línea celular que coexpresa FGFR1c+αKlothoTM, se infectaron células L6 que expresaban de manera estable FGFR1cWT (resistentes a G418) con partículas lentivirales que codificaban αKlotho (αKlothoTM) transmembrana de tipo salvaje o mutado y las células que coexpresaban se seleccionaron usando higromicina (80 μg ml-1, n.° HY-B0490, MedChemExpress).

Para los estudios de estimulación celular, se sembraron células L6 parentales y transfectadas de forma estable en placas de cultivo celular de 12 pocillos a una densidad de 1 × 105 células por pocillo y se mantuvieron durante 24 h. Al día siguiente, las células se enjuagaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se privaron de suero durante 12 hy se coestimularon con FGF23WT y αKlothoecto durante 5, 10, 20 y 40 min. Para la estimulación de un solo punto de tiempo, las muestras se recogieron después de 5 min.

Después de la estimulación, las células se lisaron y las muestras de lisados ​​totales se analizaron mediante transferencia Western, como se describió previamente33. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: FGFR fosforilado (1:1000, no. 3471S, Cell Signaling Technology), FRS2α fosforilado (1:1000, no. 3864S, Cell Signaling Technology), PLCγ1 fosforilado (1:1000, no. 2821S, Cell Signaling Technology). Signaling Technology), ERK1/2 fosforilado (1:1000, no. 4370S, Cell Signaling Technology), α-tubulina (1:20000, no. 66031-1-Ig, Proteintech), FGFR1 total (1:1000, no . 9740S, tecnología de señalización celular), FGFR2 total (1:1000, n.º 23328S, tecnología de señalización celular), FGFR3 total (1:1000, n.º ab133644, Abcam), FGFR4 total (1:1000, n.º 23328S, tecnología de señalización celular). 8562S, tecnología de señalización celular), IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP (H + L) (1:5000, n.º SA00001-1, Proteintech), IgG anti-conejo de cabra conjugada con HRP (H + L) (1:5000, n.º SA00001-2, Proteintech). Las transferencias se desarrollaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorados (n.º P10300, NCM Biotech Laboratories) mediante el sistema ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) o Amersham ImageQuant 800 (GE).

La sensibilidad a la endoglicosidasa H (Endo H) se usó para analizar los impactos potenciales de las mutaciones del ectodominio en la glicosilación/maduración de FGFR y, por lo tanto, el tráfico a la superficie celular. En las inmunotransferencias, los FGFR de tipo salvaje migran como un doblete de una banda superior difusa mayor y una banda inferior aguda menor. La banda superior representa el FGFR maduro completamente glicosilado, decorado con azúcares complejos que ha superado el control de calidad de ER y se ha transportado con éxito a la superficie celular. Por otro lado, la banda inferior que migra más rápido es una forma rica en manosa procesada de forma incompleta que queda atrapada en el RE. Las mutaciones que afectan la maduración del receptor se manifiestan en un aumento en la proporción de la banda residente en el RE que migra más rápido. La forma rica en manosa es sensible a Endo H, que escinde el enlace entre dos subunidades de N-acetilglucosamina (GlcNAc) directamente próximas al residuo de asparagina. Sin embargo, la banda residente en la superficie celular completamente glicosilada es resistente a Endo H. En consecuencia, la abundancia de FGFR en la superficie celular se puede expresar como una proporción de la fracción resistente a Endo H sobre la expresión total del receptor determinada mediante el tratamiento del receptor con PNGasa F Esta enzima es una amidasa que hidroliza el enlace entre la GlcNAc más interna y la asparagina independientemente del contenido de azúcar complejo y, por lo tanto, elimina completamente el FGFR de todos sus azúcares N-enlazados. En consecuencia, las líneas celulares WT o FGFR mutantes se lisaron en un tampón de lisis NP-40 (Biotime, n.º P0013F, complementado con PMSF 1 mM) durante 15 min a 4 °C. En primer lugar, se desnaturalizaron 20 μg de proteína total (cuantificada mediante ensayo BCA) con tampón desnaturalizante de glicoproteínas a 100 °C durante 10 min y luego se trataron con 500 unidades de Endo H (New England Biolabs, no. P0702S) o péptido-N-glicosidasa F (PNGase F) (New England Biolabs, no. P0704S) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras tratadas con Endo H y PNGasa F se inmunotransfirieron con anticuerpos específicos de isoforma FGFR, como se detalla anteriormente.

La masa molecular del complejo cuaternario FGF23–FGFR1c-αKlotho–HS purificado por SEC se determinó mediante dispersión de luz multiángulo siguiendo el protocolo establecido6. Antes del experimento, se pasaron por el sistema al menos 60 ml de tampón de funcionamiento desgasificado (HEPES 25 mM pH 7,5 que contenía NaCl 150 mM) para equilibrar la columna y establecer líneas de base estables para los detectores de índice de refracción y dispersión de luz. Luego, se inyectaron 50 μl del complejo cuaternario FGF23–FGFR1c-αKlotho–HS purificado (1,5 mg ml−1) en la columna Superdex 200 10/300 GL y el eluyente se controló continuamente a 280 nm de absorbancia, dispersión de luz láser e índice de refracción. a un caudal de 0,5 ml min−1. Como control, se analizaron 50 μl de una muestra de complejo ternario FGF23-FGFR-αKlotho purificado (1,5 mg ml-1) en las mismas condiciones. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Se usaron la intensidad de dispersión de la luz láser y los valores del índice de refracción del eluyente para derivar la masa molecular implementada por el software ASTRA (Wyatt Technology Corp.).

Las células se sembraron en cubreobjetos de microscopio (n.º WHB-12-CS-LC, WHB) colocados dentro de placas de cultivo celular de 12 pocillos a razón de 1 × 105 células por pocillo y se dejaron adherir durante 24 h. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con PBS y se privaron de suero durante 12 h. Después de la coestimulación con FGF23WT y αKlothoecto durante 20 min, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 30 min antes de PLA. La reacción de PLA se realizó utilizando un kit Duolink PLA siguiendo las instrucciones del fabricante (n.º DUO92101, Sigma-Aldrich) y se visualizó mediante microscopía de fluorescencia. Brevemente, los portaobjetos se trataron con solución de bloqueo durante 60 min a 37 °C, se enjuagaron tres veces con tampón de lavado A y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con dos anticuerpos primarios diferentes generados en dos especies diferentes para cada isoforma de interés de FGFR (FGFR1 ( 1:20, n.º PA5-25979, ThermoFisher) de conejo, FGFR1 (1:100, n.º ab824, Abcam) de ratón, FGFR2 (1:100, n.º 23328S, tecnología de señalización celular) de conejo, FGFR2 (1 :50, n.º sc-6930, Santa Cruz Biotechnology) de ratón, FGFR3 (1:100, n.º MA5-32620, ThermoFisher) de conejo, FGFR3 (1:100, n.º sc-13121, Santa Cruz Biotechnology) de ratón, FGFR4 (1:100, no. 8562S, Cell Signaling Technology) de conejo, FGFR4 (1:100, no. sc-136988, Santa Cruz Biotechnology) de ratón). Después de tres enjuagues con tampón de lavado A, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios ligados a oligo (Duolink anti-mouse minus y anti-rabbit plus) durante 1 h a 37 °C. Los portaobjetos se enjuagaron nuevamente con tampón de lavado A y se sumergieron en solución de ligasa durante 30 min a 37 °C, para permitir la formación de ADN circular, seguido de incubación con solución de polimerasa durante 100 min a 37 °C para amplificación por círculo rodante en una habitación oscura. Los portaobjetos se enjuagaron dos veces con el tampón de lavado B durante 10 min cada uno, seguido de un enjuague con una dilución de 100 veces del tampón B durante 1 min. Para el análisis de imágenes, los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos utilizando un volumen mínimo de medio de montaje Duolink PLA que contenía DAPI. Los portaobjetos se examinaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (C2si, Nikon).

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 8.0. Para el análisis estadístico de los datos de inmunotransferencia, se utilizaron valores densitométricos (determinados mediante ImageJ) de tres experimentos independientes. Para el análisis estadístico de los datos de PLA, se utilizaron varios puntos fluorescentes y células (contadas manualmente) de seis campos de microscopio elegidos al azar de dos experimentos biológicamente independientes. El procesamiento de los datos de transferencia Western y PLA en las Figs. 2c,d, 3b–d y 4b,c se realizaron mediante ANOVA de dos vías, seguido de Tukey. Se aplicó ANOVA unidireccional, seguido de Tukey para procesar los datos de transferencia de Western en Datos extendidos Fig. 3. Las purificaciones de proteínas se repitieron al menos ocho veces, lo que produjo muestras con pureza/cantidad comparables. Los experimentos de transferencia Western se llevaron a cabo en triplicados biológicos con resultados similares. Los ensayos de PLA se repitieron al menos dos veces de forma independiente, con resultados análogos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Mapas de densidad electrónica y modelos refinados para FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (EMD-34075, PDB: 7YSH), FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (EMD-34082, PDB: 7YSU) y FGF23–FGFR4–αKlotho–HS ( EMD-34084, PDB: 7YSW) los complejos cuaternarios se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica y se liberarán tras la aceptación del manuscrito. Las imágenes de western blot sin recortar sin procesar se compilan en la Fig. 1 complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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El apoyo financiero fue proporcionado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0506000 a XL), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82073705 y 82273842 a GC, 82103999 a LC, 81930108 a GL), el fondo de puesta en marcha del laboratorio de Oujiang (OJQD2022007 a MM), Premio al Plan de Acción de Kungpeng (a MM), Financiamiento de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LR22H300002 a GC, LQ22H300007 a LC), Proyecto Principal de Innovación Científica y Tecnológica de Wenzhou (ZY2021023 a GC), Plan de Talento de Qianjiang de Zhejiang (QJD1902016 a GC) y Wenzhou Fondo de puesta en marcha del Instituto (UCAS) (WIUCASQD2021043, para YW).

Estos autores contribuyeron por igual: Lingfeng Chen, Lili Fu, Jingchuan Sun, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang

Laboratorio Oujiang (Laboratorio de Zhejiang para Medicina Regenerativa, Visión y Salud Cerebral), Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, China

Lingfeng Chen, Lili Fu, Jingchuan Sun, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang, Xin Liu, Junliang Lu, Zixiang Pan, Yang Wang, Xiaokun Li, Gaozhi Chen y Moosa Mohammadi

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Medicina de Hangzhou, Hangzhou, China

Lingfeng Chen y Guang Liang

Instituto del Factor de Crecimiento Celular, Laboratorio Oujiang (Laboratorio de Medicina Regenerativa, Visión y Salud Cerebral de Zhejiang), Wenzhou, China

Lili Fu, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang, Xin Liu, Junliang Lu, Zixiang Pan, Gaozhi Chen y Moosa Mohammadi

Laboratorio estatal clave para medicamentos de macromoléculas y preparación a gran escala, Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, China

Lili Fu y Xiaokun Li

Laboratorio de Control del Destino Celular, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Westlake, Hangzhou, China

sol jingchuan

Departamento de Fisiología y Biofísica Celular, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

allen zinkle

Centro de Física Biomédica, Instituto Wenzhou, Academia de Ciencias de la Universidad de China, Wenzhou, China

yang wang

Centro Nacional de Investigación de Ingeniería de Fármacos de Factores de Crecimiento Celular y Productos Biológicos de Proteínas, Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, China

Xiaokun Li

Instituto de enfermedad renal crónica, Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, China

Gaozhi Chen

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LC expresó, purificó y preparó los complejos cuaternarios, llevó a cabo la cromatografía de exclusión por tamaño, el análisis de dispersión de luz multiángulo y preparó las figuras estructurales. LC y JS prepararon las rejillas crio-EM y recopilaron y procesaron las imágenes. AZ expresó y purificó ectodominios de FGFR. LF generó las construcciones de expresión de mamíferos. JL expresó las proteínas FGF23 mutantes. LF, ZH, MF, XL, ZP y GC generaron datos de transferencia Western y PLA y prepararon las figuras relacionadas. YW generó datos de simulación MD. MM concibió el proyecto, construyó y analizó los modelos estructurales y escribió el manuscrito. Todos los autores participaron en la discusión y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Xiaokun Li, Gaozhi Chen o Moosa Mohammadi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Makoto Kuro-o y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Flujo de trabajo de procesamiento de imágenes para el complejo cuaternario FGF23-FGFR-αKlotho-HS que contiene FGFR1c (izquierda), FGFR3c (centro) o FGFR4 (derecha) como componente receptor. La correlación de capa de Fourier estándar de oro (GSFSC) muestra resoluciones globales de 2,74, 3,20 y 3,03 Å para los complejos cuaternarios FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS, FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS y FGF23-FGFR4-αKlotho-HS, respectivamente.

A, Representación de dibujos animados de la estructura crio-EM del complejo cuaternario 1:2:1:1 FGF23-FGFR-αKlotho-HS en cuatro orientaciones diferentes relacionadas por una rotación de 90° a lo largo del eje vertical. El complejo cuaternario asimétrico tiene una dimensión promedio de 130 Å × 100 Å × 55 Å. La proximidad de los puntos de inserción de la membrana de las cadenas de FGFR (~25 Å de separación) conduciría a la formación de un dímero transfosforilador de bucle A asimétrico del dominio de quinasa intracelular27. FGF23, αKlotho y HS se muestran en naranja, azul y magenta, respectivamente. El receptor primario (FGFRP) y el receptor secundario (FGFRS) se muestran en verde pálido y cian. Las líneas discontinuas indican los residuos 172–182 de FGF23, el conector entre el núcleo de trébol de FGF23 y su sitio de unión distal de αKlotho, que no se pudo construir debido a la falta de densidad electrónica interpretable. Esta región no interactúa con αKlotho o FGFR y es probable que esté desordenada/flexible. En particular, esta región alberga el sitio regulador de convertasa de proproteína similar a subtilisina (SPC), 176RHT178R179/S180AE182, que incluye un sitio de escisión de proteasa de tipo furina (R179), un sitio de O-glicosilación (T178) y un sitio de fosforilación de serina (S180). Tres enzimas, a saber, GalNAc-T3 (N-acetilgalactosaminiltransferasa3), Fam20C (la familia con similitud de secuencia 20, miembro C) y una proteasa de tipo furina aún por descubrir convergen en este sitio para regular el procesamiento de FGF23. La alta flexibilidad de esta región probablemente sea necesaria para la acción de estas enzimas. B, la señalización de FGF23 depende estrictamente de αKlotho. Las células L6-FGFR1cWT se trataron con concentraciones crecientes de FGF23WT recombinante solo, en combinación con αKlotho soluble o se dejaron sin tratar. Lisados ​​de células enteras inmunotransferidos como en la Fig. 2c. Tenga en cuenta que incluso las concentraciones suprafarmacológicas (hasta 10 micromolar) de FGF23WT no activan la señalización de FGFR1c. Sin embargo, cuando se co-trata con αKlotho soluble, tan solo 10 nM de FGF23 induce una fuerte activación de FGFR1c. Los experimentos se realizaron en triplicados biológicos con resultados similares. C, superposición de la estructura de rayos X del complejo ternario FGF23–FGFR1c–αKlotho (ID de PDB: 5W21, coloreado en verde) en la porción correspondiente de FGF23–FGFR1cP–αKlotho dentro de la estructura crio-EM de 1:2:1:1 El complejo cuaternario FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS (coloreado en rosa) muestra un alto grado de similitud (RM)D de 1,16 Å].

a, lisados ​​desnaturalizados de L6-FGFR1cWT, L6-FGFR1cK175Q/K177Q (FGFR1cΔHBS1), L6-FGFR1cK207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS2) y L6-FGFR1cK175Q/K177Q/K207Q/R209Q (FGFR1cΔ HBS1+2) las células se incubaron con endoglicosidasa H (Endo H) o Péptido-N-Glicosidasa F (PNGasa F) o se deja sin tratar. Las muestras se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo específico de isoforma FGFR1c. Los datos de inmunotransferencia se cuantificaron como se describe en la sección Métodos y se presentan como la media ± SD. b–d, lisados ​​desnaturalizados de líneas celulares L6 que expresan de manera estable FGFR1cWT, sus cuatro sitios 2 (FGFR1cE249A, FGFR1cR254A, FGFR1cI256A, FGFR1cY280A) y un sitio 1 (FGFR1cA170D/A171D/S219D) mutantes (b), FGFR3c de tipo salvaje (F TFG3cWT) o sus cuatro mutantes del Sitio 2 (FGFR3cE247A, FGFR3cR252A, FGFR3cI254A, FGFR3cY278A) (c), FGFR4 de tipo salvaje (FGFR4WT) o sus cuatro mutantes del Sitio 2 (E243A, R248A, I250A, Y274A) (d) fueron tratados con Endo H, PNGase F o no se trata. Las muestras se inmunotransfirieron con anticuerpos específicos de la isoforma FGFR como se indica. Los experimentos se realizaron en triplicados biológicos con resultados similares. La cuantificación se realizó como se describe en la sección Métodos y se presentan como valores medios ± SD P determinados mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey.

Datos fuente

A, izquierda y centro: representaciones de dibujos animados de los componentes FGF23-FGFRS y FGFRP-αKlotho del complejo cuaternario que se muestran en la orientación obtenida a través de la alineación de los dominios D2 de FGFRS y FGFRP. Derecha: superposición de los componentes FGF23-FGFRS y FGFRP-αKlotho mediante la alineación de los dominios D3 de los receptores. Tenga en cuenta que FGF23 N-terminal y αKlotho RBA se acoplan a los surcos hidrofóbicos equivalentes en D3 de las cadenas FGFRS y FGFRP. b–d, FGF23 N-terminal sufre un cambio conformacional importante en los complejos cuaternarios FGF23–FGFR–αKlotho–HS. Representación de dibujos animados y superficie (solo para el componente FGF23) del complejo ternario libre de HS (es decir, estructura de rayos X) (b) y el complejo cuaternario inducido por HS (es decir, estructuras crio-EM) (c) en la misma orientación obtenido a través de la alineación de sus cadenas FGF23. ( d ) Representación de dibujos animados de una superposición entre FGF23-FGFR1c del complejo ternario FGF23-FGFR1c-αKlotho y FGF23-FGFR1cP del complejo cuaternario a través de la alineación FGF23. Tenga en cuenta la diferencia dramática en las posiciones de FGF23 N-terminal entre las dos estructuras. e, densidades de electrones de FGF23 N-terminal en estructuras crio-EM de complejos cuaternarios FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS en los niveles de contorno indicados. Tenga en cuenta que las densidades de electrones para FGF23 N-terminal son débiles y desiguales. f–i, los datos de simulación MD muestran que el extremo N de FGF23 se acopla con D3 de FGFR1cS. f, Izquierda: representación de dibujos animados de la estructura crio-EM del complejo cuaternario FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS. FGF23, FGFR1cP, FGFR1cS y αKlotho están en naranja, verde, cian y azul, respectivamente. Derecha: vista ampliada de la región encuadrada (izquierda) que muestra la progresión conformacional de la cola N-terminal de FGF23 (es decir, Y25 a W36) y D3 de FGFR1cS en una trayectoria de simulación MD de 300 ns indicada por una transición de color desde el naranja (0 ns) a azul (300 ns) en intervalos de 60 ns. FGF23 N-terminal interactúa con la hoja de tres hebras βC: βF: βG en el dominio FGFR1cS D3. gh, cambios en RMSD (g) y fluctuación cuadrática media (RMSF, h), respectivamente, de la cola N-terminal de FGF23 durante la simulación MD. Tenga en cuenta que RMSD de residuos N-terminal de FGF23 se estabilizó alrededor de 4 Å después de 120 ns. Es importante destacar que los residuos en los extremos distal y proximal de FGF23 N-terminal exhibieron RMSF más grande y más pequeño, respectivamente, reflejando sus respectivas densidades de electrones crio-EM (comparar e y h). i, Cambios en las distancias de cuatro pares de contactos seleccionados (Y25–L342S, S29–R254S, L31–A259S y L32–I256S) entre residuos N-terminal de FGF23 y residuos en D3 de FGFR1cS. Las distancias de los pares de residuos hidrofóbicos Y25–L342S, L31–A259S y L32–I256S fluctuaron alrededor de 5 Å, lo que indica la formación de contactos hidrofóbicos entre estos pares de residuos. Del mismo modo, la distancia por pares para S29-R254S fluctuó alrededor de 4 Å después de 120 ns, lo que indica un enlace de hidrógeno entre las cadenas laterales de este par de residuos.

ab, Justificación del ensayo de complementación del receptor. Centro: representación de dibujos animados/superficie del complejo cuaternario FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS en dos orientaciones relacionadas por una rotación de 180° alrededor del eje Y. Los círculos indican las circunferencias aproximadas de los sitios de unión del ligando en los receptores primarios y secundarios seleccionados para la mutagénesis. a, Izquierda: vista ampliada de la región circulada en el receptor secundario que muestra que Ile-203 y Ser-223 de FGFR1cS participan en contactos hidrofóbicos y de enlace de hidrógeno con residuos en el núcleo de FGF23. Derecha: vista ampliada de la región en un círculo en el receptor primario que muestra que Ala-167 y Val-248 de FGFR1cP participan en contactos hidrofóbicos altamente conservados con Tyr-124 y Leu-158 de FGF23, respectivamente. Además, Ala-167 también forma un enlace de hidrógeno con Tyr-124. b, Izquierda, vista ampliada de la región circulada en el receptor primario que muestra que las correspondientes Ile-203 y Ser-223 en FGFR1cP están expuestas al solvente. Por lo tanto, una molécula de FGFR1cI203E/S223E diseñada (es decir, FGFR1cΔSLBS) debería conservar la capacidad de actuar como receptor primario a pesar de perder la capacidad de funcionar como receptor secundario. A la derecha, vista ampliada de la región rodeada por un círculo en el receptor secundario que muestra que los correspondientes Ala-167 y Val-248 en FGFR1cS no juegan ningún papel en la formación del complejo cuaternario y están expuestos al solvente. Por lo tanto, se predice que un mutante FGFR1cA167D/V248D diseñado (es decir, FGFR1cΔPLBS) perderá la capacidad de funcionar como receptor primario pero aún podría actuar como receptor secundario. c, Demostración de complementación de receptores entre FGFR1cΔSLBS y FGFR1cΔPLBS y entre FGFR4ΔSLBS y FGFR1cΔPLBS a través de PLA. Se muestran campos de microscopía fluorescente representativos de líneas celulares estables sujetas a PLA. Barra de escala, 10 μm. Los experimentos se realizaron al menos dos veces con una repetición biológica con resultados similares. d, alineación de secuencias basada en la estructura de las regiones de unión a ligandos (es decir, D2, enlazador D2-D3 y D3) de las siete isoformas de FGFR. Como guía, se muestra una representación esquemática de un FGFR prototípico y se etiquetan sus diversos dominios. La mitad C-terminal de D3 que se somete a un empalme alternativo en FGFR1-FGFR3 se resalta en azul oscuro. Tenga en cuenta que la mitad N-terminal no empalmada de D3 se conserva entre las isoformas b y c. Los elementos de la estructura secundaria se proporcionan en la parte superior de la alineación. Los residuos que interactúan con HS están todos localizados dentro del dominio D2 y están coloreados en magenta. Los residuos que median las interfases FGF23-FGFRP y αKlotho-FGFRP son de color amarillo y verde, respectivamente. Tenga en cuenta que los residuos que median los contactos directos FGFRP-FGFRS (en azul claro) están completamente conservados entre las siete isoformas. En cuanto a la interfaz FGF23-FGFRS (en naranja), solo los residuos D2 que contactan con el núcleo de FGF23 se conservan entre las siete isoformas. Sin embargo, dos residuos D3 hidrofóbicos que interactúan con el extremo N de FGF23 en la interfaz FGF23-FGFRS se conservan solo en FGFR1c-3c y FGFR4 (indicados por puntas de flecha negras). En FGFR1b-3b, estos residuos, que se superponen con el sitio de unión para RBA de αKlotho, se reemplazan por residuos cargados. La hidrofobicidad del FGFR1b-3b del surco D3 se interrumpe aún más por la presencia de un sitio de glicosilación ligado a N único dentro de sus surcos D3 (indicado por un recuadro rojo). En FGFR2c, un residuo hidrofóbico conservado clave se reemplaza por un Lys-296 cargado (subrayado en rojo) que probablemente explica la incapacidad de FGFR2c para unirse a αKlotho.

a, Inmunotransferencias de extractos de células enteras de líneas celulares L6 transfectadas y no transfectadas sin tratar o tratadas con FGF (1 nM) que expresan de manera estable FGFR1cWT, FGFR1cE249A, FGFR1cR254A, FGFR1cI256A o FGFR1cY280A sondadas con anticuerpos contra FGFR fosforilado, PLCγ1 y FRS2α. b, Inmunotransferencias de extractos de células enteras de líneas celulares L6 no transfectadas y transfectadas y no tratadas o tratadas con FGF (1 nM para FGF1 y 2 nM para FGF3/7/10/22) que expresan de manera estable FGFR2bWT, FGFR2bE250A, FGFR2bR255A, FGFR2bI257A o FGFR2bY281A sondadas con Anticuerpo específico de isoforma FGFR2b (arriba) o anticuerpos fosfoespecíficos como en el panel a. Los experimentos se realizaron en triplicados biológicos con resultados similares.

a, Diagrama esquemático que muestra que, en respuesta a FGF1/3/7/10 y HS paracrinos, FGFR2bΔSLBS y FGFR2bΔPLBS pueden complementarse entre sí y formar complejos de señalización asimétrica 1:1:1:1 FGF-FGFR2bΔSLBS-FGFR2bΔPLBS-HS. ser, Demostración de la complementación del receptor entre FGFR2bΔSLBS y FGFR2bΔPLBS a través de western blotting. Las líneas celulares L6 que expresan individualmente FGFR2bWT, FGFR2bΔPLBS, FGFR2bΔSLBS o coexpresan FGFR2bΔSLBS con FGFR2bΔPLBS se trataron con 1 nM FGF1 (b), 2 nM FGF3 (c), 2 nM FGF7 (d) o 2 nM FGF10 (e) para intervalos de tiempo crecientes, y los extractos de células totales se sometieron a inmunotransferencia como se indica. Los experimentos se realizaron en triplicados biológicos con resultados similares.

a, Diagrama esquemático que muestra que FGF1 o FGF10, HS y FGFR1bΔSLBS (que actúa como receptor primario) forman complejos estables que posteriormente reclutan FGFR2bΔPLBS como receptor secundario. bc, las líneas celulares L6 que expresan individualmente FGFR1bWT o FGFR1bΔSLBS, o que coexpresan FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS se trataron con 1 nM FGF1 (b) o 2 nM FGF10 (c) para aumentar los intervalos de tiempo y los extractos celulares se inmunotransfirieron. d, Diagrama esquemático que muestra que, en presencia de HS, FGF3 y FGFR2bΔSLBS (que actúa como receptor primario) forman un complejo estable y posteriormente reclutan FGFR3bWT como receptor secundario. e, las líneas celulares L6 que expresan FGFR3bWT solo o coexpresándolo con FGFR2bΔSLBS se trataron con FGF3 2 nM durante intervalos de tiempo crecientes y los extractos celulares se sometieron a inmunotransferencia. Los experimentos se realizaron en triplicados biológicos con resultados similares.

a, Debido a la débil afinidad de unión al HS de la hormona FGF, el HS por sí solo es incapaz de estabilizar el complejo endocrino FGF-FGFR e inducir la dimerización/activación asimétrica sostenida del receptor. Se utilizan desenfoque y asociación suelta para enfatizar la naturaleza inestable/transitoria del supuesto complejo ternario FGF-FGFR-HS y la dimerización/activación del receptor fisiológicamente intrascendente. b, el correceptor Klotho unido a la membrana se acopla simultáneamente con el dominio D3 de FGFR y la cola C-terminal de FGF, estabilizando así el complejo endocrino FGF-FGFR dentro de un complejo ternario. Al hacerlo, el correceptor de Klotho compensa eficazmente la incompetencia del HS para estabilizar el complejo endocrino binario FGF-FGFR. HS ahora está en posición de reclutar un segundo FGFR para el complejo binario estabilizado, induciendo así la dimerización asimétrica. Sin embargo, debido a la débil afinidad de unión al HS de la hormona FGF, Klotho y los dímeros de FGF-FGFR 1:2 endocrinos inducidos por HS siguen siendo inferiores a los dímeros de FGF-FGFR paracrinos 1:2 inducidos por HS en términos de longevidad/estabilidad (indicado por una ligera borrosidad). de FGFRS en b). c, debido a sus altas afinidades de unión a HS, los FGF paracrinos pueden depender de HS como el único co-receptor para unirse de manera estable al FGFR primario y reclutar un FGFR secundario, induciendo así la formación de dímeros receptores asimétricos rígidos y de larga vida.

Figs suplementarias. 1–4 y tablas 1–2.

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Reimpresiones y permisos

Chen, L., Fu, L., Sun, J. et al. Base estructural para la señalización de la hormona FGF. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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Recibido: 06 Septiembre 2022

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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