Visualización de la actividad del sistema nervioso entérico a través del tinte

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 236 (2023) Citar este artículo

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Se han logrado importantes avances en las tecnologías de imagen, pero la mayoría de los enfoques metodológicos utilizados actualmente para estudiar las funciones neuronales entéricas se basan en tintes de contraste exógenos que pueden interferir con las funciones celulares o la supervivencia. En el presente artículo, investigamos si la tomografía de coherencia óptica de campo completo (FFOCT) podría usarse para visualizar y analizar las células del sistema nervioso entérico. El trabajo experimental en preparaciones de montaje completo de colones de ratón no fijados mostró que FFOCT permite la visualización de la red del plexo mientérico, mientras que FFOCT dinámico permite visualizar e identificar células individuales in situ en los ganglios mientéricos. Los análisis también mostraron que la señal FFOCT dinámica podría modificarse por estímulos externos como la veratridina o cambios en la osmolaridad. Estos datos sugieren que la FFOCT dinámica podría ser de gran interés para detectar cambios en las funciones de las neuronas entéricas y la glía en condiciones normales y de enfermedad.

El sistema nervioso entérico (SNE) es una red neuronal integrada presente en el tracto gastrointestinal (GI). Compuesto por neuronas y células gliales entéricas (EGC), el ENS regula funciones GI clave que abarcan la motilidad, la secreción de la mucosa, la proliferación celular, la reparación de tejidos, pero también las funciones inmunitarias1. Los defectos en la organización y funciones del SNE contribuyen a varias disfunciones GI observadas en un amplio espectro de trastornos digestivos y extradigestivos2.

En los últimos años, se han desarrollado técnicas de imágenes microscópicas para comprender mejor las funciones del ENS en condiciones normales y anormales. Por ejemplo, se han logrado avances mediante la combinación de técnicas microscópicas de alta resolución con sondas fluorimétricas como los colorantes sensibles al calcio o sensibles al voltaje3. Tecnologías como la microscopía de hoja de luz y la tomografía de proyección óptica también han proporcionado conocimientos sobre la organización y la vasculatura del ENS, que permiten el análisis de secciones de unos pocos centímetros cuadrados de tejido digestivo extirpado4,5. Sin embargo, estos enfoques técnicos solo se pueden realizar ex vivo, ya que requieren la limpieza del tejido y la tinción inmunohistoquímica. La visualización in vivo del ENS humano se logró mediante endomicroscopía confocal con sonda (pCLE), pero como la resolución y la profundidad de penetración eran demasiado bajas, fue necesaria una disección submucosa endoscópica6 o tinción con violeta de cresilo6 para obtener una imagen clara del ENS7. En este contexto, las tecnologías novedosas que proporcionan una alta resolución espacial y una imagen dinámica sin colorantes del ENS son de gran interés.

En este sentido, la tomografía de coherencia óptica (OCT) puede ser de gran utilidad ya que permite obtener imágenes de las estructuras internas de los tejidos mediante el análisis interferométrico de la luz retrodispersada y reflejada8. Esta tecnología no invasiva y de alta velocidad se basa en el contraste tisular inherente para crear una reconstrucción volumétrica del tejido. Esta estrategia de imagen es la más utilizada para diagnosticar enfermedades en el ojo humano9, pero cuando se combina con una sonda de fibra óptica, la OCT podría adquirir imágenes en el sistema cardiovascular, respiratorio o digestivo10. En el intestino, la OCT endoscópica se ha utilizado típicamente para el diagnóstico del esófago de Barrett11 y se obtuvieron datos preliminares para otras indicaciones como enfermedades inflamatorias del intestino y cáncer colorrectal12,13. La OCT endomicroscópica in vivo con una resolución típica de decenas de micras14 tiene una resolución demasiado baja para visualizar el ENS, pero se puede obtener una resolución más alta con dos implementaciones de esta técnica: FFOCT15,16 y SD-OCT de alta resolución17,18,19. En este artículo presentamos los resultados obtenidos con el FFOCT, que adquiere imágenes 2D de frente utilizando objetivos de alta apertura numérica y luz visible. Permite la generación de imágenes con resolución micrométrica y subcelular y también se pueden recolectar datos volumétricos cambiando la profundidad de adquisición de la imagen OCT en face. Su aplicación se ha explorado principalmente para la detección de márgenes tumorales intraprocedimiento en varios órganos20, incluido el cerebro21. También se ha informado para obtener imágenes de las estructuras oculares22,23. A pesar de algunos esfuerzos iniciales24, hasta el momento no se ha logrado el desarrollo de una versión endoscópica de la FFOCT. En las muestras ex vivo del intestino, FFOCT ha demostrado su capacidad para obtener imágenes del plexo mientérico en el tracto GI de ratones y humanos25. Sin embargo, este método de imagen no visualiza las neuronas y las células gliales en los ganglios entéricos, en parte debido a las fuertes señales de retrodispersión producidas por los tejidos circundantes, como las células musculares o por el ENS, y la presencia de un ruido moteado. Una nueva herramienta denominada FFOCT dinámica (D-FFOCT) ha mejorado considerablemente el contraste celular en tejidos complejos mediante el análisis de las fluctuaciones temporales de la luz retrodispersada de los tejidos y las células26. Para el análisis temporal del micromovimiento de los componentes celulares, que es la base del contraste intrínseco de la D-FFOCT, las señales de OCT se recopilan a lo largo del tiempo desde el mismo plano de imagen, lo que a su vez también reduce el ruido adicional y mejora la calidad de la imagen. El contraste dinámico también se implementó en la tecnología SD-OCT de alta resolución, que proporciona imágenes transversales del tejido, en comparación con el plano de imagen frontal del D-FFOCT27. Se utilizó micro-OCT con contraste dinámico para la visualización de la microanatomía de las vías respiratorias28, el cuello uterino y el esófago29. Los esfuerzos recientes se centran en mejorar aún más la velocidad de adquisición y la calidad de imagen de D-FFOCT y micro-OCT con contraste dinámico para permitir la obtención de imágenes in vivo30,31,32. Al mismo tiempo, la tecnología micro-OCT se ha traducido con éxito a un diseño endoscópico33,34. Se presentó el diseño preliminar del endoscopio micro-OCT con contraste dinámico35, pero el desafío de la estabilización del tejido durante la adquisición de datos prolongada necesaria para extraer el contraste dinámico sigue siendo una limitación importante. Los mecanismos celulares que subyacen a las fluctuaciones temporales de las señales de OCT también siguen siendo desconocidos, pero los cambios en la actividad metabólica celular podrían ser parcialmente responsables, ya que la inhibición de la actividad mitocondrial con rotenona o de la glucólisis con 2-desoxi-D-glucosa redujeron significativamente la intensidad de la señal de OCT26. Curiosamente, las células epiteliales o inmunitarias individuales que no pudieron identificarse individualmente mediante FFOCT, podrían visualizarse mediante D-FFOCT36. Esto es alentador, pero hasta la fecha, no se sabe nada sobre la capacidad de D-FFOCT para obtener imágenes del ENS o los mecanismos biológicos subyacentes a las señales D-FFOCT de las células ENS.

En el presente estudio, FFOCT y D-FFOCT analizaron segmentos colónicos extirpados de ratones adultos para demostrar la capacidad de esta tecnología para obtener imágenes de neuronas y células gliales en el plexo mientérico, y para medir cambios en las señales D-FFOCT vinculadas a electrofisiología neuronal. actividad.

Para determinar si FFOCT se puede usar para identificar ganglios mientéricos sin ningún tipo de marcado con colorante, se colocaron preparaciones de montaje completo de segmentos de colon distal de ratones en el soporte de Sylgard y se tomaron imágenes usando FFOCT. Las imágenes se adquirieron a profundidades consecutivas de 0,5 µm a partir del nivel de la serosa externa. Las capas musculares longitudinal (Fig. 1a) y circular (Fig. 1c) se identificaron claramente ya que sus fibras son perpendiculares entre sí. Curiosamente, las diez a doce imágenes FFOCT registradas entre las dos capas musculares mostraron una red oscura delineada por regiones refractarias (Fig. 1b). Para confirmar que estas estructuras oscuras correspondían al plexo mientérico, las muestras de tejido previamente captadas por FFOCT se inmunoteñeron con anticuerpos contra Hu y S100β para identificar neuronas y células gliales entéricas, respectivamente (Fig. 1d-f). Usando estos enfoques combinados, pudimos demostrar que FFOCT se puede usar para identificar estructuras formadas por ganglios y tractos de fibras interganglionares desde la red oscura observada en FFOCT superpuesta con la tinción Hu / S100β (Fig. 1f). Sin embargo, las neuronas individuales y/o las células gliales presentes dentro del plexo mientérico no pudieron identificarse mediante FFOCT.

a–c El colon de los ratones se analizó mediante FFOCT a nivel de un músculo longitudinal, b plexo mientérico y c músculo circular. El área seleccionada del plexo mientérico se visualizó mediante d FFOCT y mediante e apotoma después del inmunomarcaje de las neuronas (Hu en rojo) y las células gliales entéricas (S100b en verde). La imagen fusionada (f) confirma que las áreas oscuras observadas por FFOCT corresponden a ganglios y tractos de fibras interganglionares. Barra de escala: a–c 200 µm; d–f 100 µm.

En D-FFOCT, las imágenes del área seleccionada se adquieren a lo largo del tiempo, lo que permite el análisis de los movimientos en cada vóxel y, por lo tanto, proporciona un contraste adicional que permite resolver las células y el núcleo. Usando este enfoque, pudimos identificar previamente células epiteliales individuales a lo largo del intestino humano36. Aquí, hemos analizado las muestras de tejido por D-FFOCT para determinar si esta técnica se puede utilizar para identificar células individuales dentro de los ganglios mientéricos.

Como se ilustra en la Fig. 2, la comparación de las imágenes FFOCT y D-FFOCT mostró claramente estructuras que solo fueron detectadas por el modo dinámico (Fig. 2a-f). Algunas de estas estructuras probablemente eran núcleos individuales como lo indica su morfología y su localización en los ganglios. Las imágenes D-FFOCT generadas por el escáner Light-CT son imágenes RGB pseudocoloreadas en las que cada canal de color se basa en el análisis de dominio de Fourier de los micromovimientos integrados en tres rangos de frecuencia diferentes. Las frecuencias baja [0–0,6 Hz], media [0,6–5,4 Hz] y alta [5,4–25 Hz] se codificaron con colores en azul, verde y rojo, respectivamente (Fig. 2g–i). Para mejorar el contraste y visualizar y cuantificar la información funcional, las imágenes RGB se dividieron en imágenes monocromáticas correspondientes a sus tres canales de color. Usando este enfoque, pudimos discriminar entre estructuras ganglionares y extraganglionares debido a las diferencias en la intensidad y amplitud de la señal dentro del tejido. Primero, la amplitud de todas las señales de frecuencia fue significativamente mayor en las estructuras ganglionares en comparación con las estructuras extraganglionares (Fig. 2j). Además, en las estructuras ganglionares, la amplitud de las señales de alta frecuencia fue mayor en comparación con las señales de baja frecuencia. Este no fue el caso en las estructuras extraganglionares. Finalmente, en ambas estructuras, la amplitud de las señales de media frecuencia fue mayor en comparación con las de baja y alta frecuencia.

a–d Micrografía de la región del plexo mientérico en FFOCT (a, b) o D-FFOCT (c, d). b y d representan una ampliación del área punteada en (a) y (c), respectivamente. e, f Vista ortogonal de diferentes planos (x/y; x/z e y/z) de FFOCT (e) y D-FFOCT (f) imágenes de pila z (60 imágenes). Las puntas de las flechas señalan la posición de la "imagen de frente" en la vista ortogonal. g–i La micrografía D-FFOCT en (c) es una imagen codificada en RGB en la que el canal azul (g) representa las frecuencias bajas [0–0,6 hercios], el canal verde (h) corresponde a las frecuencias medias [0,6– 5,4 hercios] y el canal rojo (i) a frecuencias altas [5,4–25 hercios]. j La intensidad media de las frecuencias baja (azul), media (verde azulado) o alta (bermellón) se determinó en las regiones intra y extraganglionares del plexo mientérico. Se usaron tres animales para determinar la intensidad media +/- SEM y se analizaron cinco regiones independientes por animal. Estadística: prueba t de Mann y Whitney de dos colas. *p < 0,05; *** p < 0,001. Barra de escala: a, c, g–i, 125 µm; b, d, 30 µm; e–f, x/y 30 µm, x/z e y/z 12 µm. MP plexo mientérico, Mu mucosa.

Como primer enfoque para identificar las estructuras detectadas por D-FFOCT en el plexo mientérico, D-FFOCT se combinó con métodos histológicos y de inmunotinción estándar que se utilizan actualmente para marcar núcleos y caracterizar células del sistema nervioso entérico. Para este fin, las muestras de tejido obtenidas por D-FFOCT se fijaron y tiñeron con 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorante fluorescente permeable a las células que se une al ácido desoxirribonucleico (ADN). La superposición de imágenes D-FFOCT con micrografías confocales de alta potencia de tinción DAPI mostró claramente que las estructuras de tipo nuclear detectadas en el plexo mientérico por D-FFOCT corresponden a núcleos marcados con DAPI (Fig. 3a-h). Curiosamente, D-FFOCT no pudo visualizar todos los núcleos. De los 261 núcleos marcados con DAPI contados en los ganglios mientéricos, 27 no se visualizaron mediante D-FFOCT (punta de flecha blanca en la Fig. 3e-h). Es de destacar que no se detectó ningún núcleo D-FFOCT en las regiones extraganglionares, mientras que podrían estar presentes células como las células musculares. Esta observación sugiere una señal FFOCT dependiente de células o morfología.

a–d Imagen combinada (c, d) de micrografías confocales (b) teñidas con D-FFOCT (a) y DAPI. Se analizó y comparó la misma región del plexo mientérico de ratón. En d, solo la imagen de alta frecuencia (roja) de D-FFOCT se superpuso con la imagen confocal DAPI (blanca) para ver claramente la colocalización de la señal. Barra de escala: 25 µm. e–h ampliación del área punteada en (a–d). La punta de flecha apunta a un núcleo DAPI positivo que no es detectado por D-FFOCT. Barra de escala: 10 µm. i-k Micrografía de los mismos ganglios visualizados por D-FFOCT (i) o por apotoma después de la inmunotinción Hu (j) o S100b (k). Las células Hu y S100b que se superponen con núcleos positivos para D-FFOCT se señalaron con flechas y puntas de flecha, respectivamente. Barra de escala: 25 µm. l–n Imagen combinada de micrografías confocales D-FFOCT (rojo), Dapi (blanco) y Hu (l; verde) o S100b (m, amarillo) de alta frecuencia de un ganglio mientérico de ratón. En los mismos ganglios, se indicaron núcleos D-FFOCT positivos (puntas de flecha simples) y negativos (puntas de flecha dobles). Las puntas de flecha anaranjadas y las puntas de flecha dobles señalaron núcleos D-FFOCT ubicados junto con Hu, mientras que la punta de flecha blanca y la punta de flecha doble indicaron núcleos D-FFOCT ubicados junto con S100b. Barra de escala: 25 µm. o Distribución de frecuencia de tamaño de los núcleos positivos para D-FFOCT que co-localizaron con la tinción de Hu o S100b. Se analizaron 344 núcleos dentro de 13 ganglios de 3 ratones (agrupados en un rango de 10 µm2). p Área media en µm2 de núcleos D-FFOCT positivos neuronales (Neu, n = 219) o gliales (EGC; n = 125). Valor medio +/− SEM; Estadística: prueba t de Mann y Whitney de dos colas. q Intensidad media de los núcleos neuronales (Neu, n = 219) o gliales (EGC, n = 125)) para las frecuencias baja (azul), media (verde azulado) o alta (bermellón). Valor medio +/− SEM; Estadística: prueba t de Mann y Whitney de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Para caracterizar las células con núcleos positivos para D-FFOCT, los tejidos se fijaron, se inmunoteñeron con anticuerpos contra marcadores neuronales (Hu) o gliales (S100β) y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia apotómica. Como se ilustra en la Fig. 3i-k, la gran mayoría de las estructuras de tipo nuclear observadas por D-FFOCT se superpusieron con la tinción de Hu (flechas) o S100β (punta de flecha). La superposición de imágenes D-FFOCT a las obtenidas por microscopía confocal después de la inmunohistoquímica y la tinción DAPI (Fig. 3l, m) reveló que las estructuras nucleares D-FFOCT se detectaron en células Hu-positivas positivas para DAPI (puntas de flecha naranja en la Fig. 3l , n). Como lo indican las puntas de flecha doble naranja, pocas neuronas positivas para DAPI positivas para Hu no exhibieron estructuras nucleares D-FFOCT. Con respecto a las células gliales, se detectaron estructuras nucleares D-FFOCT en una gran mayoría de células gliales positivas para DAPI positivas para S100β (puntas de flecha blancas en la Fig. 3m, n), pero algunas células positivas para DAPI positivas para S100β no fueron visibles por D -FFOCT (puntas de flecha dobles blancas en la Fig. 3m, n). El recuento de células mostró que las estructuras nucleares detectadas por D-FFOCT estaban presentes en el 96 % de las neuronas (163 núcleos de 170) y el 78 % de EGC (71 núcleos de 91) que contenían núcleos positivos para DAPI.

Para determinar si la morfología y/o la intensidad RGB de las estructuras nucleares D-FFOCT podrían usarse para discriminar núcleos de neuronas y células gliales, se analizó su distribución de tamaño. Los resultados revelaron distribuciones gaussianas. Para las células gliales, el pico se localizó en la parte izquierda del histograma que correspondía a los núcleos pequeños, mientras que para las neuronas, el pico estaba más a la derecha que correspondía a los núcleos grandes (Fig. 3o). Esta observación está respaldada por el hecho de que el área media de las estructuras nucleares EGC D-FFOCT era casi dos veces más pequeña que el área media de las estructuras nucleares neuronales D-FFOCT (49,9 µm² +/− 15,8 frente a 89,9 µm² +/− 17,9, respectivamente, media +/− SD) (Fig. 3p). Curiosamente, mostramos que un valor de corte de 65 µm2 nos permitió discriminar el 78,4% del EGC y el 92,7% de las neuronas en las fracciones por debajo y por encima de 65 µm2, respectivamente. Se compararon las amplitudes de las frecuencias D-FFOCT. Los resultados indicaron que la intensidad media de todas las frecuencias de las señales fue significativamente mayor en las neuronas en comparación con las células gliales (Fig. 3q).

Para determinar si las señales de D-FFOCT podrían ser moduladas por la actividad neuronal, se adquirieron imágenes de los ganglios completos mediante D-FFOCT antes y 30 minutos después de la adición de veratridina, un activador del canal de Na (Fig. 4a).

una micrografía D-FFOCT de los mismos ganglios visualizada antes (T0) y después de un tratamiento de 30 min con veratridina 75 µM (T1). Barra de escala: 30 µm. b, c Relación T1:T0 expresada como porcentaje de la intensidad media para el rango de frecuencia bajo (azul), medio (verde azulado) o alto (bermellón) después de un tratamiento con vehículo (0,1% vol/vol DMSO) o 75 µM veratridina (Vera). La intensidad media se calculó a partir de los ganglios completos (b) o de la estructura nuclear (c) como se indica en la parte superior del panel. d, e Mismo experimento que en (c) pero los núcleos se subdividieron en función de su tamaño >65 µm (d) y <65 µm (e). Veratridina, n = 20 ganglios de 4 ratones; DMSO, n = 20 (b, d) o 18 (c, e) ganglios de 4 ratones. Valor medio +/− SEM; Estadística: prueba t de Mann y Whitney de dos colas. *p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Luego se analizó la intensidad media para el rango de frecuencia bajo, medio y alto. Como se observa en la Fig. 4b, la veratridina indujo un aumento en la intensidad de las señales de alta y media frecuencia y una reducción significativa en la intensidad de las señales de baja frecuencia en todos los ganglios en comparación con el control (Fig. 4b, 5 ganglios por animal). por condición recogida de 4 animales, control: DMSO 0,1% vol/vol). A continuación, se examinó el impacto de la veratridina en las señales de D-FFOCT a nivel de un solo núcleo. En comparación con el control, se observó un aumento en la intensidad de las señales de frecuencia media y alta en los núcleos tratados con veratridina, mientras que no se notó ningún cambio en las frecuencias bajas (Fig. 4c, 100–300 núcleos por animal en 4 animales). Curiosamente, se observaron algunas señales nucleares D-FFOCT que no se detectaron en condiciones basales en núcleos tratados con veratridina (Fig. 1a complementaria, flechas). Para determinar si los cambios en las señales de D-FFOCT dependían del tipo de célula, los resultados se clasificaron en función del valor de corte del tamaño nuclear que discrimina entre células neuronales (tamaño nuclear >65 µm2) y células gliales (tamaño nuclear <65 µm2). µm2). En comparación con el control, el tratamiento con veratridina aumentó significativamente la intensidad de las señales de frecuencia media y alta en la población celular con un tamaño nuclear > 65 µm2, que correspondía principalmente a las neuronas (Fig. 4d). La veratridina también indujo un aumento significativo en la intensidad de las señales de alta frecuencia en la población celular con tamaño de núcleo <65 µm2, constituida principalmente por células gliales (Fig. 4e). Finalmente, los cambios en las señales de D-FFOCT inducidas por la veratridina se revirtieron después del lavado con solución de Krebs (Fig. 1b, c complementarias).

Como la actividad neuronal moduló las señales de D-FFOCT en las células neuronales y gliales, examinamos si la inhibición farmacológica de la actividad neuronal basal con la tetrodotoxina (TTX) afecta las señales de D-FFOCT (Fig. 5a). El análisis de la totalidad de los ganglios tras el tratamiento con TTX reveló que la toxina no modificaba la intensidad de las señales de media o alta frecuencia pero sí reducía significativamente la intensidad de las señales de baja frecuencia (fig. 5b). Además, no se observaron cambios significativos en las señales de frecuencia D-FFOCT en las estructuras nucleares después del tratamiento con TTX (Fig. 5c).

una micrografía D-FFOCT de los mismos ganglios antes (T0) y después de un tratamiento de 30 min con 1 µM de tetrodotoxina (T1). Barra de escala: 30 µm. b, c Relación T1:T0 en porcentaje de la intensidad media para rango de frecuencia bajo (azul), medio (verde azulado) o alto (bermellón) para un tratamiento con vehículo (Krebs) o tetrodotoxina (TTX). La intensidad media se calculó a partir de los ganglios completos (b) o de la estructura nuclear (c). tetrodotoxina, n = 25 ganglios de 5 ratones; Krebs, n = 15 ganglios de tres ratones. Valor medio +/− SEM; Estadística: prueba t de Mann y Whitney de dos colas. ** p < 0,01.

Las observaciones de que el aumento de la actividad neuronal moduló las señales de D-FFOCT en los núcleos neuronales y gliales nos llevaron a investigar más a fondo los supuestos mecanismos que subyacen a estos cambios. Curiosamente, se ha demostrado que la actividad neuronal está asociada con modificaciones de la morfología nuclear debido a cambios en la actividad transcripcional37. Entre otros factores que se sabe que regulan la morfología nuclear también se encuentra el estrés osmótico38,39. En particular, se ha demostrado que la hiperosmolaridad induce la contracción nuclear o contrae la morfología nuclear y, supuestamente, altera sus propiedades vibratorias cuyas modificaciones podrían detectarse con D-FFOCT.

Para validar esta hipótesis, analizamos si el cambio en la presión osmótica tuvo un impacto en las señales D-FFOCT en las células ENS (Fig. 6a). Curiosamente, el aumento de la concentración de manitol indujo una disminución significativa en la intensidad de las señales D-FFOCT para frecuencias bajas, medias y altas en los ganglios (Fig. 6b) pero también en el núcleo de las células ganglionares (Fig. 6c). Este efecto fue reversible ya que las señales D-FFOCT en los ganglios (Fig. 2b complementaria) y en los núcleos (Fig. 2c complementaria) volvieron a su valor inicial después del lavado con solución de Krebs (Fig. 2a complementaria),

una micrografía D-FFOCT de los mismos ganglios antes (T0) y después de un tratamiento de 30 min con vehículo (Krebs), 100, 200 o 300 mM de manitol (T1). Barra de escala: 25 µm. b, c Relación T1:T0 en porcentaje de la intensidad media para rango de frecuencia bajo (azul), medio (verde azulado) o alto (bermellón) para un tratamiento con vehículo (Krebs, 0) o 100, 200, 300 mM de manitol. La intensidad media se calculó a partir de los ganglios completos (b) o de la estructura nuclear (c). n = 15 ganglios de 3 ratones. Valor medio +/− SEM; Estadística: para cada color, prueba de Kruskal-Wallis de dos colas seguida de una de Dunn. *p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001.

En el presente estudio, mostramos que el análisis de frecuencia de tiempo de las señales OCT o D-FFOCT permitió la identificación in situ de neuronas entéricas y células gliales en preparaciones de colon de ratón. Las frecuencias de las señales de OCT en los núcleos de las neuronas entéricas y la glía fueron más altas que las registradas en las regiones extraganglionares y, curiosamente, los estímulos externos, como la activación neuronal o la hiperosmolaridad, indujeron cambios reversibles en las fluctuaciones de la señal de OCT. En el futuro, el uso de esta técnica podría aportar nuevos conocimientos sobre los cambios en las funciones entéricas y de la glía en la salud y las enfermedades.

El modo de imagen FFOCT reveló estructuras reflectantes bajas en la interfaz entre los músculos longitudinales y circulares, que fueron identificados por inmunohistoquímica como el plexo mientérico. Hallazgos similares se obtuvieron previamente en ratones utilizando las técnicas de OCT, lo que permitió detectar cambios en la densidad de los ganglios mientéricos en modelos animales de la enfermedad de Hirschsprung25. Las imágenes FFOCT también mostraron estructuras altamente refractivas que coincidían con los ganglios en la interfaz entre los músculos longitudinales y los ganglios mientéricos (Fig. 1a). Estas estructuras altamente refractivas posiblemente estén formadas por compuestos ricos en colágeno, cuyas moléculas son importantes para la adhesión de los ganglios a los músculos longitudinales40. Curiosamente, la composición de esta matriz extracelular se ve alterada en condiciones patológicas como la enfermedad inflamatoria intestinal41 o la enfermedad de Hirschsprung42. Por tanto, FFOCT podría ser una herramienta interesante para detectar cambios en la composición de la matriz extracelular. En este sentido, recientemente mostramos una reducción en las señales FFOCT altamente reflectantes en la mucosa del colon de pacientes con espina bífida que se correlacionaron con una disminución significativa en la intensidad de la tinción con rojo de Sirio, un marcador de depósitos de colágeno43.

FFOCT no nos permitió visualizar células individuales en los ganglios mientéricos, a diferencia de otros estudios25. Esta discrepancia puede explicarse por diferencias tecnológicas como la lente del objetivo o la intensidad de la fuente de luz entre el sistema FFOCT comercial que usamos (Light CT-scanner, LLTech), pero D-FFOCT brinda la posibilidad de obtener imágenes de células individuales en todo el espesor del tejido intestinal, en particular en estructuras bien definidas como el plexo mientérico y la capa de células epiteliales. Por lo tanto, este enfoque técnico se utilizó recientemente para discriminar células epiteliales en las biopsias humanas de las diferentes partes del tracto intestinal36. Además, D-FFOCT ofrece la posibilidad de integrar los movimientos subcelulares y proporciona imágenes según la intensidad de las frecuencias emitidas. Los componentes subcelulares como los núcleos, caracterizados por frecuencias medias y altas elevadas, fueron claramente visibles por D-FFOCT en los ganglios mientéricos, y el análisis de inmunohistoquímica indicó que estos núcleos correspondían a neuronas o células gliales. Curiosamente, el 96% de las neuronas intraganglionares fueron visibles por D-FFOCT mientras que D-FFOCT discernió pocos o ningún elemento celular en las regiones extraganglionares o en las capas musculares. Como la señal de D-FFOCT podría estar relacionada con la actividad metabólica de las estructuras subcelulares en movimiento, se podría plantear la hipótesis de que estas diferencias son la consecuencia de un nivel diferente de actividad metabólica en las células. La investigación de la separación de frecuencia óptima entre tres canales de color podría ser interesante para mejorar aún más la visualización del ENS. Además, se pudo observar cierta falta de coincidencia en la forma y las posiciones de los núcleos entre D-FFOCT e imágenes confocales después de la inmunotinción. Esto probablemente se deba a las deformaciones inducidas por el proceso de fijación y tinción entre las dos adquisiciones, que elegimos ignorar, y el error de registro en sí mismo que no se puede evitar debido a la resolución de la imagen44. De hecho, el registro se realizó de forma rígida, sin permitir deformaciones, para evitar una deformación sesgada de las formas. Esta restricción rígida nos permitió afirmar con confianza que eran los núcleos y no las células los que se pueden observar en D-FFOCT, pero condujo a la pequeña falta de coincidencia observada.

En el presente estudio, también demostramos que las señales de D-FFOCT en neuronas y células gliales podrían modificarse por estímulos externos. Primero mostramos que la hiperosmolaridad disminuía las señales nucleares FFOCT de manera reversible. Curiosamente, se sabe que la hiperosmolaridad altera la unión de la proteína al ADN e induce un proceso de condensación de ADN reversible comparable a la mitosis45. Por lo tanto, la disminución reversible de las señales de D-FFOCT después de la adición de una concentración creciente de manitol podría deberse a la reducción del movimiento del ADN debido a la condensación del ADN del núcleo. Además de la osmolaridad, nuestro objetivo fue determinar el impacto de la actividad neuronal en las señales de D-FFOCT, ya que el aumento de la actividad neuronal activa la actividad transcripcional en las neuronas, en particular a través de vías intracelulares como las proteínas quinasas activadas por mitógenos46. De hecho, el cambio en los estados de cromatina dependientes de la actividad podría tener un impacto en el estado vibratorio del núcleo. Aquí, informamos que la estimulación de la actividad neuronal con veratridina desencadenó un aumento en las señales D-FFOCT de frecuencia media y alta en los núcleos de las neuronas y las células gliales presentes en los ganglios mientéricos. Aunque las células gliales no se activan directamente con la veratridina, el aumento de la señal de D-FFOCT podría ser consecuencia de las interacciones neurogliales posteriores a la activación neuronal. Curiosamente, se observaron núcleos que no se detectaron en los ganglios mientéricos en condiciones basales después del tratamiento con veratridina (Fig. 1 complementaria). Tal inducción no se observó después de estímulos hiperosmolares. Además, se desconocen las razones que subyacen al hecho de que no se observaron cambios significativos en las señales de frecuencia de D-FFOCT en las estructuras nucleares después del tratamiento con TTX. Sin embargo, esto podría deberse al hecho de que, en condiciones basales, la actividad neuronal es baja, por lo que la adición de TTX solo induciría pequeños cambios en la actividad que no podrían detectarse con nuestro sistema. Se requieren más investigaciones para comprender la base molecular de las señales de D-FFOCT en los ganglios mientéricos, pero nuestros datos sugieren que los cambios en el estado vibratorio de los núcleos podrían estar relacionados con la condensación del ADN nuclear y/o la variación en la actividad transcripcional.

Nuestro presente estudio proporciona la primera demostración de que D-FFOCT podría usarse para obtener imágenes e identificar in situ las células neuronales y gliales en el plexo mientérico. Los cambios en las frecuencias vibratorias de los núcleos en respuesta a estímulos fisiológicos y no fisiológicos sugieren que D-FFOCT también podría ser útil para analizar la actividad celular y detectar funciones celulares anormales.

Se alojaron ratones macho C57BL/6J Rj de 8 a 12 semanas de edad (Laboratorio Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Fr) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua. Los investigadores fueron acreditados por la Agencia Veterinaria Nacional Francesa y los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones del Comité local de Cuidado y Uso de Animales de Nantes (Francia). Después de un período de adaptación de 1 semana, los animales se sacrificaron por dislocación cervical para la recolección de tejido. Se extirpó rápidamente todo el intestino de cada ratón y se colocó en una solución de Krebs helada (NaCl, 117 mM; KCl, 4,7 mM; MgCl2, 1,2 mM; NaH2PO4, 1,2 mM; NaHCO3, 25 mM; CaCl2, 2,5 mM; glucosa, 11 mM).

Se recogieron tejidos intestinales de ratones adultos, se lavaron con solución de Krebs fría y se cortaron en trozos pequeños. Luego, los segmentos del colon distal se abrieron longitudinalmente a lo largo del mesenterio, se estiraron y se fijaron en Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) adaptado para portamuestras.

Las imágenes FFOCT y D-FFOCT se realizaron utilizando el escáner Light-CT (LLtech, Paris, Fr) colocado en una mesa antivibratoria (CleanBench con aislamiento de vibración Gimbal Piston, Photon Lines SAS, St Germain-en-Laye, Fr). La placa portadora de Sylgard se colocó en el soporte del escáner con suficiente solución para evitar que se secara. Después de iluminar la muestra con una fuente de luz halógena, la luz reflejada de la muestra interfirió con la luz del brazo de referencia en el interferómetro de Linnik, antes de ser detectada por una cámara de megapíxeles. Se recopilaron imágenes bidimensionales (2D) "en face" con un campo de visión de 1,25 mm × 1,25 mm y un tamaño de vóxel de 1 µm × 1 µm × 1 µm. El sistema permitió la exploración de la profundidad de la muestra hasta alrededor de 150 µm de profundidad. Para D-FFOCT, se recopilaron 1000 imágenes a 300 Hz (imágenes de interferómetro de salida cada 3,3 ms durante 3,3 s). Para mejorar el rendimiento de la relación señal-ruido, se aplicó un promedio no superpuesto de cuatro imágenes como filtro de paso bajo para amortiguar de manera efectiva las frecuencias más altas y, a su vez, suprimir el ruido mientras se miden más fotones. Para maximizar la relación señal-ruido en el escáner Light-CT comercial, las bandas de integración RGB están preestablecidas en el canal azul de baja frecuencia (0–0,6 Hz), el canal verde de frecuencia media (0,6–5,4 Hz) y el canal alto. -canal rojo de frecuencia (5,4–25 Hz).

Después de la obtención de imágenes FFOCT, las muestras de colon se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 3 h a temperatura ambiente, se lavaron y almacenaron en PBS NaN3 (1 g por litro) hasta su uso. La permeabilización se logró incubando los tejidos durante 48 h a 36 h en PBS NaN3 suplementado con suero de caballo al 10 %, tritón X100 al 3 % y saponina al 0,05 % a 4 °C con agitación. Luego, las muestras se incubaron durante 24 h en tampón permeabilizado con anticuerpos primarios anti-Hu (anticuerpo monoclonal humano 1:500, regalo) y anti-S100b (policlonal de conejo 1:3, Dako Agilent, Santa Clara, EE. UU.) a temperatura ambiente bajo agitación. Después del lavado, las muestras se incubaron durante 5 h en tampón permeabilizado con anticuerpos secundarios Cy5 anti-conejo de cabra diluido a 1:500 (Jackson Immuno Research, Cambridge House, Reino Unido) y Cy3 anti-humano de burro diluido a 1/500 (Jackson Immuno Research ) a temperatura ambiente con agitación. Después del lavado, se realizó una contratinción nuclear durante 10 min a temperatura ambiente, utilizando DAPI (1:1000 en PBS Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE. UU.) y las muestras se montaron entre portaobjetos y cubreobjetos con medio de montaje antifading (Prolong gold antifade, Thermofisher , Waltham, Estados Unidos).

Los especímenes se vieron utilizando el AxioZoom.V16 fluorescente (Zeiss, Marly le Roi, Fr) asociado con Aptome2. Las imágenes confocales también se obtuvieron utilizando el microscopio confocal Nikon A1 RSi (Nikon SAS, Champigny sur Marne, Fr) con dos objetivos 60x y 20x. Las imágenes de FFOCT y apotome se alinearon con el complemento T. 3D D-FFOCT (software de Fiji) "Align Image by line ROI"47 mientras que las imágenes 3D confocales se alinearon con el software ICY48 como se describe a continuación.

Las imágenes de D-FFOCT se alinearon usando ec-clemv244 bajo ICY.

Para evaluar con precisión el contenido de D-FFOCT a nivel celular, el registro se realizó en 3D para tener en cuenta el cambio de pose de la muestra entre los dos sistemas, y asumiendo estrictamente que la deformación del tejido será insignificante a esta escala. Después de la imagen D-FFOCT (Fig. 3a complementaria), se tomaron imágenes de las muestras en el confocal Nikon A1R a 20x para obtener una imagen de referencia para facilitar la identificación del área de interés (Fig. 3e complementaria). Luego, se adquirió una pila en un campo de visión arbitrario a 60x (Fig. 3f complementaria). La proyección de intensidad máxima del 20x primero se registró manualmente en el D-FFOCT utilizando la estructura de interés y estableciendo la restricción para que no haya escalado ni deformación en la transformación (solo se permite la rotación y la traslación). Esto da la matriz de transformación 2D de 20x a D-FFOCT. Incluso si la cantidad de píxeles en ambas imágenes era muy diferente, ec-clemv2 usó el tamaño de píxel para calcular la transformación en la unidad de micrómetro, según los metadatos de las imágenes proporcionados por los instrumentos, lo que nos permitió restringir la transformación para que sea rígida. La proyección de intensidad máxima de la adquisición confocal de 60x se encontró automáticamente en la proyección de intensidad máxima de 20x utilizando la parte Autofinder de ecclev2. utilizando un protocolo icy personalizado. Esto da la transformación 2D de 60x a 20x. Estas transformaciones se combinaron para calcular usando la función de transformación en cascada de ecclev2 y se invirtieron para dar la transformación D-FFOCT a 60x 2D. Esta transformación se aplicó a la pila completa D-FFOCT y sirvió como inicialización para el registro rígido 3D que se basó en el centro seleccionado manualmente de lo que se suponía que coincidía con algunos núcleos (alrededor de 10 puntos localizados en 3D en ambas imágenes). La restricción rígida nos permitió no deformar las imágenes y verificar el buen emparejamiento de los núcleos no utilizados para el registro.

Para discriminar y cuantificar cada tamaño nuclear de las células neuronales y gliales, se superpusieron imágenes D-FFOCT e imágenes de apótomos con el algoritmo "Align Image by line ROI plugin" de FIJI.

Para el análisis nuclear, se crearon máscaras a partir de las imágenes D-FFOCT utilizando el complemento WEKA dentro de Fiji. Se informó que las máscaras dividían las imágenes en rojo, verde y azul. Luego se analizó el ROI 2D, con parámetros de intensidad media, para cada compartimento. Determinamos la intensidad del valor medio de 125 núcleos gliales y 219 núcleos neuronales.

Después de marcar las áreas a analizar, se tomaron imágenes de D-FFOCT de cada muestra de tejido fijada en Sylgard antes del tratamiento (T0). A continuación, se retiró la muestra de la placa portadora, se colocó en placas de cultivo celular de 6 pocillos y se trató con 75 µM de veratridina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE. UU.), 1 µM de TTX (Bio-Techne SAS, Noyal-Châtillon sur Seiche , Francia), 100 mM, 200 mM y 300 mM de D-manitol (Sigma-Aldrich), DMSO al 0,1 % (vol/vol) (control de veratridina) o Krebs (control de TTX y manitol) durante 30 min a temperatura ambiente bajo agitación (200 rpm). Luego, cada muestra de tejido tratado fijada en Sylgard se devolvió al soporte del escáner con la misma presión y localización (X, Y) para obtener imágenes mediante D-FFOCT (T1). Luego, cada muestra de tejido se lavó dos veces durante 15 minutos cada una y se tomaron imágenes nuevamente mediante D-FFOCT (T2).

Las imágenes D-FFOCT de los ganglios adquiridas antes del tratamiento (T0), después del tratamiento químico (T1) y después del lavado (T2) se alinearon usando la "función Alinear" dentro de Fiji.

Para el análisis de ganglios completos, los ganglios observados en T0 se rodearon manualmente para crear una máscara que dividió las imágenes rojas, verdes y azules adquiridas en T0, T1 y T2 y midió la intensidad media en todos los ganglios. El azul corresponde a la frecuencia baja (LF, 0–0,6 Hz), el verde a la frecuencia media (MF, 0,6–5,4 Hz) y el rojo a la frecuencia alta (HF, 5,4–25 Hz).

Para el análisis nuclear, se crearon máscaras a partir de las imágenes adquiridas en T0 utilizando el complemento WEKA49 dentro de Fiji (Fig. 4 complementaria). Se informó que las máscaras dividían las imágenes en rojo, verde y azul. La intensidad media de cada núcleo se calculó en T0, T1 y T2. Cuando el resultado se expresó en porcentaje de T0, se calcularon los valores para cada núcleo y se usaron los valores medios por ganglio.

El número de experimentos independientes se especifica en las leyendas de las figuras. La significancia estadística se determinó utilizando la prueba t no paramétrica de Mann y Whitney de dos colas o la prueba de Kruskal-Wallis de dos colas seguida de una prueba de Dunn. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism (GraphPad Prism 8.0, GraphPad software Inc) y las diferencias con un valor de p de 0,05 o menos se consideraron estadísticamente significativas. *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos numéricos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y su archivo de datos complementarios). Las micrografías presentadas en el presente estudio están disponibles en el repositorio [OMERO] [https://omero.os-bird.glicid.fr/webclient/?show=project-315 login: guest_user contraseña: ¡Bienvenido!1].

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Este trabajo fue apoyado por Mibiogate (Convención 2016-11179) de "Région Pays de la Loire" y la Fondation SantéDige. Reconocemos la instalación IBISA MicroPICell (Biogenouest), miembro de la infraestructura nacional France-Bioimaging apoyada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-10-INBS-04). PP-G. cuenta con el apoyo de la ANR CROCOVAL (ANR-18-CE45-0015).

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Michel Neunlist, Philippe Naveilhan.

Nantes Université, CHU Nantes, Inserm, TENS, El sistema nervioso entérico en enfermedades intestinales y cerebrales, IMAD, Nantes, Francia

Tony Durand, Lara Laboudie, Emmanuel Coron, Isabelle Neveu, Michel Neunlist y Philippe Naveilhan

Universidad de Nantes, CNRS, INSERM, instituto del tórax, F-44000, Nantes, Francia

Perrine Paul Gilloteaux

Universidad de Nantes, Hospital Universitario de Nantes, Inserm, CNRS, SFR Health, Inserm UMS 016, CNRS UAR 3556, F-44000, Nantes, Francia

Perrine Paul Gilloteaux

Centro Wyss de Bioingeniería y Neuroingeniería, Campus Biotech, Ginebra, Suiza

michalina gora

Laboratorio ICube, CNRS, Universidad de Estrasburgo, Estrasburgo, Francia

michalina gora

Departamento de Gastroenterología y Hepatología, Hospital Universitario de Ginebra (HUG), rue Gabrielle Perret-Gentil 4, 1211, Genève, 1205, Suiza

Emmanuel Coron

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MN, PN y TD contribuyen al diseño, la concepción y la interpretación de la obra; TD, LL, PP-G. y PN adquirieron, analizaron e interpretaron los datos; TD, PN y MN redactaron el MS; PP-G., MG, EC e IN revisión crítica del manuscrito.

Correspondencia a Michel Neunlist.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Chao Ren y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Chao Zhou y Manuel Breuer.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Durand, T., Paul-Gilloteaux, P., Gora, M. et al. Visualización de la actividad del sistema nervioso entérico mediante tomografía de coherencia óptica de campo completo dinámica sin colorantes. Comun Biol 6, 236 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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Recibido: 19 Agosto 2022

Aceptado: 14 febrero 2023

Publicado: 02 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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