La alteración en la fosforilación de tirosina del proteoma cardíaco y la vía EGFR contribuyen a la miocardiopatía hipertrófica

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1251 (2022) Citar este artículo

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Las alteraciones de la fosforilación de serina/treonina del proteoma cardíaco son un sello distintivo de la insuficiencia cardíaca. Sin embargo, la contribución de la fosforilación de tirosina (pTyr) a la patogenia de la hipertrofia cardíaca sigue sin estar clara. Utilizamos el mapeo global para descubrir y cuantificar pTyr específico del sitio en dos modelos de ratones hipertróficos cardíacos, es decir, la sobreexpresión cardíaca de ErbB2 (TgErbB2) y la cadena pesada de miosina α R403Q (R403Q-αMyHC Tg), en comparación con los corazones de control. A partir de esto, existen alteraciones fosfoproteómicas significativas en ratones TgErbB2 en las vías de miocardiopatía ventricular derecha, miocardiopatía hipertrófica (MCH) y miocardiopatía dilatada (MCD). Por otro lado, los ratones R403Q-αMyHC Tg indicaron que la vía EGFR1 es fundamental para la hipertrofia cardíaca, junto con la activación de las vías de señalización de angiopoyetina, ErbB, hormona del crecimiento y quimiocinas. Sorprendentemente, la mayoría de las proteínas de miofilamento tienen una regulación a la baja de pTyr en lugar de una regulación al alza. El análisis de enriquecimiento de sustrato de quinasa (KSEA) muestra una marcada regulación a la baja de la actividad de la vía MAPK aguas abajo de k-Ras en ratones TgErbB2 y la activación de las vías EGFR, adhesión focal, PDGFR y citoesqueleto de actina. La inhibición de ErbB2 in vivo por AG-825 disminuye el desorden de los cardiomiocitos. La serina/treonina y el fosfoproteoma de tirosina confirman las vías descritas anteriormente y la eficacia del tratamiento AG-825. Por lo tanto, pTyr alterado puede desempeñar un papel regulador en modelos hipertróficos cardíacos.

La miocardiopatía hipertrófica familiar (MCH) aumenta el grosor de la pared del ventrículo izquierdo (VI); las condiciones de carga anormales no pueden explicar esta alteración. Las mutaciones en los genes que codifican las proteínas del sarcómero son comunes en los pacientes con MCH (40-60 %)1. El estudio de las modificaciones postraduccionales (PTM) de las proteínas del sarcómero (o proteínas de manejo de Ca2+) puede ofrecer una oportunidad única para comprender mejor cómo los trastornos genéticos conducen a la disfunción cardíaca y descubrir objetivos potenciales para la terapia2,3,4. Por ejemplo, los PTM de la troponina I cardíaca (cTnI), una proteína del sarcómero involucrada centralmente en la regulación de la contractilidad miocárdica, se han estudiado ampliamente, en particular por el papel funcional de la fosforilación dependiente de la proteína quinasa A5. En particular, la fosforilación de cTnI-S22/23, uno de los sitios reguladores más relevantes de cTnI, está regulada a la baja en la insuficiencia cardíaca humana (IC)6 y conduce a una disfunción contráctil7.

La fosforilación de tirosina (pTyr) es esencial para el desarrollo estructural cardíaco y la organización de las miofibrillas durante la embriogénesis8,9. Por ejemplo, varias tirosina fosfatasas se han relacionado con enfermedades cardíacas e incluso se han propuesto como diana terapéutica para algunas afecciones. Además, las mutaciones de la tirosina-proteína fosfatasa no receptora tipo 11 (PTPN11) pueden provocar MCH o miocardiopatía dilatada (MCD)10,11. En el corazón, PTPN11 probablemente juega un papel en la disfunción sistólica producida por la sobrecarga de presión12. La fosfatasa ácida 1 (ACP1) es otra tirosina fosfatasa asociada con la fisiopatología cardíaca. En consecuencia, su deleción protege frente a la miocardiopatía inducida por estrés13. Nuestro grupo mostró por primera vez que la fosforilación de cTnI-Y26 se detecta fácilmente en corazones humanos sanos y se regula a la baja en HF y DCM14 humanos. Sin embargo, la forma en que estas alteraciones contribuyen a la aparición y progresión de la enfermedad cardíaca sigue siendo poco conocida. Una mejor comprensión de los cambios adicionales específicos del sitio de los sitios individuales fosforilados en tirosina ayudaría sustancialmente en esta dirección.

El presente estudio aplicó un enfoque de proteómica de fosfotirosina global cuantitativa de etiquetado de masa en tándem (TMT) y sin etiqueta para determinar qué sitios de sarcómero tienen cantidades alteradas de fosforilación de Tyr en sitios específicos en dos modelos no relacionados de HCM. El primer modelo es secundario a la sobreexpresión del receptor de tirosina quinasa ErbB215,16. El segundo recapitula las características de la enfermedad humana, más específicamente, una mutación R403Q de la cadena pesada de la miosina de la proteína miofilamento, distintiva de la HCM17 familiar. Los ratones TgErbB2 inicialmente desarrollan una hipertrofia cardíaca concéntrica llamativa, que evoluciona a fibrosis difusa y desorden de miocitos16 con MCH. Esta línea de ratones también tiene un manejo anormal del calcio, es propensa a las arritmias y a desarrollar una miocardiopatía hipertrófica obstructiva2. De manera similar, los ratones R403Q-αMyHC reproducen la MCH familiar humana al progresar desde una hipertrofia y fibrosis leves hasta un desorden miocitario manifiesto, insuficiencia cardíaca y arritmias17.

El principal impulso detrás de este estudio fue determinar si la activación de la MCH a través de diferentes mecanismos provoca vías/sitios reguladores relacionados con pTyr similares dentro del corazón. Al hacerlo, la manipulación de estos sitios pTyr, a su vez, ofrecería nuevas oportunidades para la orientación terapéutica en diferentes formas de MCH humana.

Primero, realizamos un análisis de inmunotransferencia del miocardio de ratones TgErbB2, R403Q-αMyHC y no transgénicos (Ntg) para estimar pTyr. Hubo una disminución global de pTyr en homogeneizados de corazón completo de ratones TgErbB2 (p = 0,0298) y R403Q-αMyHC (p = 0,003) en comparación con Ntg (Fig. 1a, b). La señal de pTyr se normalizó a los niveles de expresión de troponina I (Fig. 1a). Aunque el protooncogén tirosina-proteína quinasa Src (c-Src) está aguas abajo de la señalización de ErbB2, no anticipamos su mayor expresión en ratones R403Q-αMyHC (Fig. 1c, d, p = 0.0414) cuando se normaliza a las señales de transferencia western de GAPDH . La actividad de c-Src (fosforilación de c-Src Tyr416) ​​pareció mejorar en ratones R403Q-αMyHC en comparación con Ntg; sin embargo, no alcanzó significación estadística (Fig. 1e, f, se usó ANOVA unidireccional para comparar grupos). En conjunto, estos datos sugieren que pTyr es un PTM ampliamente distribuido en el miocardio. Por lo tanto, su regulación positiva o negativa puede desempeñar un papel regulador en la progresión de la enfermedad de las miocardiopatías no isquémicas, como en el caso de la miocardiopatía familiar (MCH) y la MCD, como parte de la respuesta fisiopatológica a la enfermedad subyacente.

a Los Western Blot muestran una disminución de pTyr en ratones TgErbB2 (p = 0,0298) y homogeneizados de corazón R403Q-α-MyHC (p = 0,003). La señal de troponina I muestra la carga de proteína total correspondiente. b El análisis de densitometría muestra que después de que la señal de ptirosina se normalizó a cTnI total, los ratones TgErbB2 y R403Q-α-MyHC disminuyeron significativamente en pTyr. c Los Western Blot muestran niveles de expresión de Src total y p-Src (Tyr 416) y GAPDH como control de carga. d El análisis de densitometría reveló que los niveles de Src están significativamente elevados en R403Q-α-MyHC (p = 0,0282), mientras que e y f muestran que los niveles de fosforilación de p-Src están elevados en R403Q-α-MyHC pero no alcanzaron significación estadística. Las señales en d y e se normalizaron a GAPDH total, mientras que en f pSRC se normalizó a SRC total. Ntg (n = 3), TgErbB2 (n = 3) y R403Q-α-MyHC (n = 3), las barras de error representan SEM Se usó ANOVA unidireccional para comparar grupos.

A continuación, adoptamos un enfoque proteómico de fosfo-tirosina TMT global para comparar el perfil pTyr de corazón completo de ratones Ntg, TgErbB2 y R403Q-αMyHC (Fig. 2). Presumimos que el perfil de pTyr global e imparcial de todo el corazón proporcionaría un panorama completo sobre los sitios específicos de tirosina en proteínas esenciales específicas del corazón y tirosina quinasas, lo que proporcionaría pistas sobre qué tirosina quinasas median en la pTyr cardiaca. Se recolectó un total de 1800 espectros de péptidos coincidentes (PSM) del proteoma completo del ventrículo cardíaco, y el 50 % se identificó con alta confianza, lo que resultó en 213 (R403Q-αMyHC), 214 (Ntg), 217 (TgErbB2) péptidos únicos fosforilados en tirosina correspondiente a 499 proteínas (Fig. 2g). Las tablas con todas las fosfoproteínas y fosfopéptidos identificados se proporcionan en los Datos complementarios 3. La calidad, la intensidad y la distribución de los datos de espectrometría de masas después de la normalización del barrido medio se incluyen en las Figuras complementarias 1a, b. Se evaluó la confianza de la localización del sitio fosforilado para la anotación y se requirió una puntuación de más del 49 %. Este conjunto de datos indica que se logró un rendimiento comparable de identificación de péptidos, reproducibilidad en el enriquecimiento de péptidos pTyr y datos de MS/MS de alta calidad utilizando enfoques similares a otros18,19,20.

a Los tejidos ventriculares se enjuagaron con PBS y se sometieron a estabilización térmica utilizando un estabilizador de tejido T1 para maximizar la conservación de la fosforilación, luego se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. b Corazones de ratones Ntg, TgErbB2 y R403Q-αMyHC (n = 5 por grupo) se procesaron en paralelo para obtener lisados ​​de corazón completo; Se usaron 30 mg de lisados ​​de proteínas de cada corazón de ratón para la digestión de tripsina en solución, un total de 150 mg de proteína tripsinizada por genotipo se desalinizaron con C18 y se liofilizaron a -20 °C durante tres días. c Un total de 150 mg de péptidos trípticos (material agrupado de 5 corazones por grupo) se enriquecieron con ptirosina mediante precipitación por inmunoafinidad (perlas de agarosa proteica + 300 microgramos de mAb anti-pTyr) y se desalinizaron en puntas de etapa C18. d RP-HPLC ESI (ionización por electropulverización) MS/MS se realizó en un LTQ Orbitrap Elite (Thermo Scientific) durante 120 min en un gradiente lineal de acetonitrilo (4-40%). Los datos sin procesar se buscaron con Mascot 2.3 y la cuantificación sin etiquetas con cromatogramas de iones extraídos de MS1 se realizó con MaxQuant. Este enfoque se repitió tres veces con muestras de los tres grupos en paralelo; 15 corazones por genotipo en tres repeticiones técnicas. e Se usó una fracción del flujo continuo del enriquecimiento de pTyr para un 9-plexTMT; Se agruparon tres réplicas de cada genotipo (Ntg, TgErbB2 y R403Q-αMyHC), se fraccionaron en RPLC para la cuantificación completa del proteoma. Los datos de pTyrosine y Full Proteome se procesaron de manera similar. normalizar datos. Los análisis se detallan en el texto y en los datos complementarios. g Muestra la superposición de proteínas fosforiladas encontradas en los tres grupos, mientras que h muestra los péptidos fosforilados en tirosina superpuestos entre los tres grupos.

El enfoque global de proteómica de fosfo-tirosina de TMT identificó 499 proteínas fosforiladas en tirosina diferentes, 294 proteínas fosforiladas en tirosina que se superponen entre el Ntg y el miocardio de dos modelos hipertróficos cardíacos (TgErbB2 y R403Q-αMyHC). A nivel de péptido, se detectaron 217 sitios pTyr con una superposición de 178 residuos fosforilados en tirosina (Fig. 2g, h).

A continuación, la atención se centró en las proteínas cardíacas específicas del aparato de miofilamentos. Se fosforilaron en tirosina nueve proteínas principales de miofilamento. Albergan múltiples sitios de aminoácidos pTyr, muchos de los cuales son nuevos (consulte la Fig. 2 complementaria); el mejor ejemplo es Titin, con 36 sitios de aminoácidos pTyr (consulte la Fig. 3 complementaria). Además, diecisiete tirosina quinasas tenían péptidos fosforilados en tirosina detectables; por lo tanto, podrían participar potencialmente en la regulación del miofilamento cardíaco pTyr.

Por el contrario, sólo dos tirosina fosfatasas (Ptpn11 y Ptpra) tenían péptidos fosforilados en tirosina detectables; por lo tanto, es probable que desempeñen un papel en la regulación de los niveles cardíacos de pTyr en el sarcómero. Además del número de tirosina quinasas encontradas con péptidos fosforilados, quince serina/treonina quinasas tenían péptidos tirosina fosforilados detectables; sin embargo, solo una serina/treonina fosfatasa (Ppp1r12b) demostró péptidos fosforilados en tirosina. Estos datos muestran que pTyr está ampliamente distribuido en el proteoma cardíaco (sarcómero cardíaco y otros subproteomas) y que una interacción entre tirosina cinasas/fosfatasas con serina/treonina cinasas/fosfatasas podría estar regulando pTyr del sarcómero cardíaco.

A continuación, realizamos análisis bioinformáticos para definir el impacto de la sobreexpresión cardíaca de ErbB2 y la mutación R403Q de la cadena pesada de la miosina cardíaca en los cambios específicos de pTyr. Determinamos las vías de transducción de señalización asociadas con dos tipos no relacionados de HCM. La normalización de la señal espectral de pTyr se realizó sobre las sondas isobáricas de TMT de corazón global completo que cuantificaron el proteoma completo (Fig. 2e, f), y se realizaron métodos estadísticos, como se describió anteriormente21,22. Luego, se aplicaron análisis de componentes principales (PCA) y agrupamiento jerárquico para determinar si los perfiles de pTyr eran similares dentro de los grupos. Este enfoque reveló que los tres grupos se segregan por el componente principal 1 (PC1 = 46%) en la cuantificación completa del proteoma (Fig. 3a). Este hallazgo también fue evidente después de la normalización de pTyr al proteoma completo; los tres grupos se segregan a lo largo del componente principal (PC1 = 52,2%) (Fig. 3b). Cabe destacar que se eliminó una réplica técnica/biológica de R403Q-αMyHC porque tenía más del 50 % de péptidos pTyr ausentes en comparación con las otras dos réplicas. Por lo tanto, se consideró una falla técnica. Los mapas de calor de péptidos pTyr normalizados regulados hacia arriba o hacia abajo agrupados jerárquicamente ayudaron a visualizar la reproducibilidad técnica y la especificidad de cómo el genotipo de la hipertrofia cardíaca influyó en gran medida en la remodelación del proteoma pTyr (Fig. 3c, p <0.05 por ANOVA). Los péptidos fosforilados en tirosina están codificados por colores de acuerdo con las intensidades de señal MS1 del cromatograma extraído normalizadas a la intensidad del péptido marcador isobárico TMT MS2. El amarillo está regulado al alza y el azul está regulado a la baja. Este enfoque nos proporcionó la abundancia mundial de péptidos de tirosina del proteoma cardíaco. Estos resultados demuestran que los ratones Ntg, TgErbB2 y R403Q-αMyHC tienen un proteoma pTyr con una firma distinta, evidenciada por PCA y mapas de calor agrupados en métodos estadísticos imparciales no supervisados.

un PCA no supervisado del proteoma cardíaco completo de ratones no transgénicos, TgErbB2 y R403Q-αMyHC muestra una segregación distinta de los grupos experimentales. Los grupos se segregan junto con el primer componente principal (PC #1), que representa el 46% de la correlación total en la expresión del Proteoma Completo (normalizado, media = 0, varianza = 1). b PCA no supervisada de la señal de péptidos de ptirosina normalizada a la expresión completa del proteoma. Los grupos también se segregan junto con el primer componente principal (PC #1), lo que representa el 52,2 % de la correlación total. c Se utilizó un mapa de calor para visualizar el agrupamiento jerárquico no supervisado de péptidos de ptirosina normalizados a la expresión completa del proteoma con un valor de p < 0,05 mediante ANOVA. Sobrerrepresentado (amarillo) y subrepresentado (Azul). d Gráfica de volcán que muestra el cambio de pliegue de Log2 y el valor p de –Log10 de cada péptido pTyr en la comparación por pares de Ntg y TgErbB2. Los puntos de datos resaltados en rojo muestran una intensidad significativamente menor, mientras que los datos en verde muestran una intensidad significativamente mayor. Los sitios significativos se magnificaron en la figura (cuadrados punteados) para etiquetar algunos sitios peptídicos. Los puntos de datos magenta coinciden con los genes significativamente asociados con las vías de la enfermedad MsigDB. El punto de datos cian no alcanzó significación estadística aunque apunta a la vía EGFR1. e Gráfico de volcán que muestra el cambio de pliegue de Log2 y el valor p de –Log10 de cada péptido pTyr en la comparación por pares de Ntg y R403Q-αMyHC. Los puntos de datos rojos y verdes se codificaron por colores como se indicó anteriormente. Con un aumento similar al anterior, los puntos de datos cian muestran una asociación significativa con la ruta EGFR1 por PTMsigDB. f Molecular Signature DB (MSigDB) y Molecular PTMs Signature DB (PTMsigDB) de los datos globales de pTyr identificaron vías que se alteraron significativamente.

Se detectaron cambios estadísticamente significativos (cambio de pliegue Log2 > 1, -valor Log p < 1,3) en 23 fosfositos correspondientes a 18 proteínas en ratones TgErbB2 (Fig. 3d) y 45 fosfositos en 35 proteínas en ratones R403Q-αMyHC Tg (Fig. 3f) mediante ANOVA (p < 0,05). Cabe destacar que pTyr de varios péptidos de la cadena pesada de alfa-miosina (Myh7-Y386, Y410, Y1375), un péptido de la cadena pesada de beta-miosina (Myh6-Y1349) y dos péptidos de Titina (Ttn-Y2118, Y21190) están regulados a la baja, mientras que Ttn Y-31324 pTyr cardíaco está regulado al alza en corazones de ratones TgErbB2 (Fig. 3d). Curiosamente, la fosforilación de Myh7-Y410 está regulada negativamente en TgErbB2 y regulada positivamente en corazones de ratones R403Q-αMyHC Tg (Fig. 3e). Por el contrario, cTnI Y113 (Tnni3-Y113) pTyr está regulado a la baja en ambos modelos de HCM pero solo alcanzó significación estadística en corazones de ratones R403Q-αMyHC Tg. La fosforilación de titina (TtnY1881, Y1901 e Y33864) se reguló significativamente en el último modelo.

Utilizamos MATLAB, un software PhoshoEnrichment hecho a medida (M. Ayati), que integra la base de datos de firmas moleculares (MsigDB)23 y una base de datos novedosa de firmas de fosforilación de quinasas, perturbaciones y vías de señalización (PTMsigDB)24 específicas del sitio de PTM. El Instituto Broad creó las bases de datos, que comprenden una colección bien seleccionada de conjuntos de datos genéticos anotados y PTM. PTMsigDB explica los cambios específicos del sitio de fosfo y su impacto en la activación o inhibición de una vía determinada, junto con las perturbaciones biológicas de sistemas experimentales más comunes. La ventaja de estas herramientas bioinformáticas es evaluar la importancia estadística de cada ruta y perturbación (nivel de gen y nivel de sitio) mediante una prueba hipergeométrica. Aquí, el número de fosfositos y genes identificados se utiliza como población para el parámetro del modelo hipergeométrico en lugar de todos los genes conocidos.

Se realizó un análisis de enriquecimiento de vías en genes/sitios significativos utilizando un nivel de proteína de gen con MSigDB. Las vías importantes de los ratones TgErbB2 son la miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho (ARVC), HCM, DCM y la señalización de integrina AlphaIIB Beta3 (Fig. 3f). Las vías más importantes de R403Q-αMyHC Tg son la vía del receptor de angiopoyetina, la vía de señalización de ErbB, la vía de señalización del receptor de la hormona del crecimiento y la vía de señalización de las quimiocinas (Fig. 3f).

Ambos modelos animales Tg mostraron una alteración notable en la placofilina-2 (PKP2) pTyr en el sitio Y119, aunque en los corazones TgErbB2 estaba regulado a la baja y en los corazones R403Q-αMyHC Tg estaba regulado al alza (Fig. 3e). El análisis MsigDB del flujo global de TMT de todo el corazón a través de todo el proteoma se muestra en Datos complementarios 3. PKP2 es un componente fundamental de los desmosomas del miocardio. Las mutaciones en este gen se asocian con miocardiopatía arritmogénica25,26,27. Por lo tanto, la fosforilación alterada de Plakophilin-2 podría tener un impacto funcional.

En comparación, PTMsigDB reveló que el análisis de la ruta en el nivel específico del sitio fosforilado no alcanzó significación estadística para la ruta EGFR1 en ratones TgErbB2; solo dos fosfositos específicos del sitio coincidían con la vía EGFR1; están resaltados en color cian en la gráfica Volcano (Fig. 3d) y la tabla PTMsigDB (Fig. 3f). Curiosamente, en ratones R403Q-αMyHC, la misma vía fue estadísticamente significativa; vea los diez cambios específicos del sitio que coincidieron con la vía EGFR1 (p = 0,001) representados en el gráfico del volcán como puntos de datos cian (Fig. 3e) y la tabla PTMsigDB (Fig. 3f). Estos datos muestran la utilidad de las bases de datos específicas del sitio de fosforilación para reducir la búsqueda de una vía biológicamente relevante en conjuntos de datos de fosfoproteómica, particularmente en eventos de fosforilación poco estudiados como pTyr con conjuntos de datos pequeños hasta la fecha.

Utilizamos una proteómica de etiquetado cuantitativo TMT para obtener una visión más específica de los cambios de pTyr del miofilamento. Más específicamente, planteamos la hipótesis de que el enriquecimiento de miofilamentos mejoraría el número de sitios de identificación en las proteínas de miofilamentos, especialmente aquellas con modificaciones de fosfo-tirosina de baja abundancia que pueden haberse perdido utilizando el enfoque global. Con este fin, utilizamos miofilamentos recién aislados de ratones Ntg y TgErbB2, como se describe en "Métodos" 28, con modificaciones menores. Usamos tres corazones por genotipo para caracterizar el proteoma pTyr de miofilamento (Fig. 4a, b), como se describe para el fosfoproteoma de insuficiencia cardíaca20. Brevemente, realizamos un experimento TMT de 6 plex a gran escala en el que la mayoría de los péptidos marcados con TMT se enriquecieron para pTyr (Fig. 4c). Adoptamos un flujo de trabajo similar a la proteómica de fosfo-tirosina TMT de corazón completo para un mayor análisis de datos estadísticos (Fig. 4d). Se eliminaron los péptidos identificados con espectros individuales, lo que condujo a 24.727 PSM. Después de la normalización del barrido medio, 1116 péptidos correspondieron a 1092 proteínas. Consulte la Fig. 4a, b complementaria para ver la distribución de intensidad espectral antes y después de la normalización (Fig. 4c, d complementaria). Para el proteoma pTyr, se recolectaron 4391 PSM y se siguió la misma curación de control de calidad de todo el proteoma para eliminar los datos faltantes y los espectros únicos, lo que condujo a 3064 PSM. Los datos sin procesar de la distribución de la intensidad espectral del proteoma pTyr se muestran antes de la normalización (Fig. 5a, b complementarias) y después de la normalización (Fig. 5c, d complementarias) y PCA (Fig. 5b). Después de la normalización del barrido medio, 832 péptidos correspondían a 184 proteínas diferentes. Se cuantificó la pTyr específica para 146 péptidos porque tenían los péptidos correspondientes de los datos de expresión del proteoma completo.

Se aislaron recientemente miofilamentos de corazones de ratones transgénicos Ntg (n = 3) y ErbB2 (n = 3) en tampones enfriados con hielo que contenían cócteles de inhibidores de proteinasa y fosfatasa (Roche). b Todo el material se resuspendió en TEAB, luego se redujo y alquiló. Los péptidos trípticos se desalinizaron y marcaron con etiquetas de masa en tándem isobárico (TMT) de 6 plex. c Los péptidos digeridos y marcados se combinaron y desalinizaron con C18 SEP-PAK. El enriquecimiento de fosfotirosina se realizó con el kit PTMScan Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) (Cell Signaling Technology). Las muestras de péptidos eluidas se desalinizaron utilizando el sistema de cromatografía líquida de nanoflujo C18 STAGE tips d Easy-nanoLC 1200 acoplado a Orbitrap Fusion Lumos Tribrid.

un proteoma completo se marcó con TMT, y las intensidades de señal de proteína registradas y resumidas indican que los grupos experimentales se segregan junto con el primer componente principal (PC n.º 1), que representa el 53,9 % de la correlación total en el proteoma de expresión (normalizado, promedio = 0, varianza = 1). b PCA del proteoma fosfo-Tyr revela una tendencia similar, y los grupos se segregan a lo largo del PC#1, que representa el 47,2 % de la correlación. c Las intensidades de señal del proteoma fosfo-Tyr se normalizaron a la expresión de la proteína del proteoma completo y se analizaron mediante análisis de componentes principales. La firma distintiva de pTyr sigue siendo evidente en PC#1 y representa el 57 % de la correlación. d Se usó un mapa de calor para visualizar la agrupación de correlación jerárquica no supervisada de la expresión de proteínas y la expresión del proteoma pTyr con p < 0,05 mediante la comparación de la prueba t de 2 muestras moderada por LIMMA de TgErbB2 y el grupo Ntg. f Gráfica de volcán que muestra el cambio de pliegue Log2 y el valor p -Log10 de cada péptido pTyr en la comparación por pares de Ntg y TgErbB2. Los puntos de datos en rojo mostraron una intensidad significativamente menor, mientras que los puntos de datos en verde mostraron una intensidad significativamente mayor. Para mayor claridad de la presentación, solo se destacaron algunos péptidos. g Molecular Signature DataBase (MSigDB) confirmó los objetivos y la participación de Dilated and HCM KEEG Pathways también se encontró en ratones TgErbB2 en la Fig. 3.

El primer paso del análisis utiliza PCA no supervisado y agrupamiento jerárquico. El análisis de PCA mostró la correlación entre los miembros del mismo grupo (Fig. 5a-c), el proteoma completo, el proteoma pTyr y el proteoma pTyr normalizado se segregan bien a lo largo de PC1, mostrando una correlación de expresión del 57,6 %, 82,4 % y 62,1 %. respectivamente. Los mapas de calor de la expresión agrupada jerárquicamente ayudaron a visualizar cómo la sobreexpresión cardíaca de TgErbB2 influyó en gran medida en la agrupación de genotipos. Ambos patrones, proteínas del proteoma completo (Fig. 5d) y la intensidad normalizada del proteoma pTyr (Fig. 5e), sugirieron una remodelación reflejada (377 proteínas para el proteoma completo y 51 péptidos pTyr tenían una p < 0,05 por LIMMA moderado 2- comparación de prueba t de muestra).

El proteoma completo detectó 1116 péptidos que correspondían a 1092 proteínas. Una comparación del cambio de pliegue Log2 (FC) de Ntg/TgErbB2 mostró 377 proteínas con diferencias estadísticamente significativas (Log2 FC > 1 y valor de p < 0,05). Al igual que la fosfotirosina de TMT de corazón global normalizada a datos completos de proteoma, los cambios de expresión de proteínas estadísticamente significativos se sometieron a MSigDB para el análisis de vías. Los resultados se muestran en Datos complementarios 4.

Utilizamos 146 fosfo-sitios correspondientes a 50 proteínas para analizar la fosforilación del proteoma pTyr o el proteoma pTyr normalizado. Los ratones TgErbB2 mostraron cambios significativos en 21 sitios pTyr (Fig. 5g) correspondientes a 15 proteínas. Se detectó un aumento sustancial de pTyr en MLC1-Y82, Y139, Myh6-Y1310, α-Tm-Y261, Actin-Y168, MyBP-C-Y544 y Actinin2-Y200, entre otras proteínas. El análisis de la ruta de MsigDB arrojó resultados similares al enfoque global de fosfo-tirosina TMT en corazones completos (Fig. 3). Los datos de pTyr del sarcómero TgErbB2 también muestran que las vías más importantes son DCM y HCM (Fig. 5g, h). Curiosamente, cuando se normaliza a ErbB2 total, los niveles de fosforilación de ErbB2-Y1006 disminuyen. Por otro lado, el análisis de las rutas de PTMsigDB no coincidió con ninguna ruta porque muchos sitios son nuevos y no se informan en la base de datos de PTMsigDB.

Nuestros datos muestran que el enriquecimiento de las proteínas del sarcómero detectó más péptidos pTyr de miofilamento que se pasaron por alto en el enfoque global de los lisados ​​​​de corazón completo. Sin embargo, el número total de péptidos fosforilados en tirosina y proteínas correspondientes fue menor.

KSEA se utilizó para caracterizar los cambios de señalización inducidos por el genotipo mediante la estimación de la actividad relativa de la quinasa en ratones TgErbB2 y R403Q-αMyHC utilizando los datos proteómicos de ptirosina del sarcómero cuantitativo global pTyr TMT y TMT de corazón completo, utilizando sus respectivos grupos Ntg como referencia. KSEA29 es un método que infiere la actividad diferencial de las quinasas basándose en la fosforilación diferencial de sus sustratos y calcula puntuaciones que reflejan el cambio direccional en la actividad de cada quinasa. Este método supone que la actividad diferencial de las quinasas se correlaciona con los cambios de fosforilación en sus sustratos. Una puntuación positiva corresponde a una quinasa con sustratos fosforilados en ratones Tg con respecto al control Ntg. Asimismo, una puntuación negativa es una hipofosforilación en Tg con respecto a su control Ntg. Los datos de interacción quinasa-sustrato se descargaron del sitio web PhosphoSitePlus30. A continuación, se aplicó el método KSEA a todos los sitios pTyr identificados en estos experimentos. Identificamos 34 fosfositos que tienen quinasas asociadas informadas en PhosphoSitePlus. Sin embargo, se puntuaron 49 quinasas únicas en los conjuntos de datos combinados. En la Fig. 6a se muestra un mapa de calor KSEA inferido de grupos de quinasas regulados negativamente (escala de color azul) o regulados positivamente (escala de color rojo). Los ratones TgErbB2 mostraron una importante regulación a la baja de MAP2K4, MAP3K6, MAP3K5, MAP2K3 y MAP2K6, y una marcada regulación al alza de EPHA4. Por otro lado, R403Q-αMyHC Tg mostró una regulación negativa sustancial de GSK3B (ver el rectángulo azul resaltado en la Fig. 6a). R403Q-αMyHC Tg mostró un grupo más grande de quinasas significativamente reguladas al alza (ver el rectángulo rojo resaltado en la Fig. 6a).

a KSEA sobre datos de enriquecimiento pTyr de corazones enteros y TMT pTyr Myofilament enriquecimiento. Los mapas de calor informan los resultados de KSEA de acuerdo con las puntuaciones normalizadas (es decir, TgErbB2/Ntg, R403Q-αMyHC/Ntg, etc.). Solo se incluyen las quinasas compartidas entre conjuntos de datos, por lo tanto presentes en Tg y Ntg. Los asteriscos indican la significación estadística de p < 0,05. El rojo representa una puntuación positiva y el azul una puntuación negativa. El rectángulo rojo resalta los grupos de quinasas activadas que se agrupan y predominan en R403Q-αMyHC, mientras que el rectángulo azul resalta las quinasas suprimidas que se agrupan y predominan en los corazones enteros TgErbB2. b MoBaS identificó una subred estrechamente interconectada involucrada en la señalización de factores de crecimiento (ERBB, PDGFRA y EGFR1). Representada por la subred de PPI con la puntuación más alta llamada Módulo 1, se identificó en el enriquecimiento de pTyr de corazón completo con TgErbB2 y se comparó con R403Q-αMyHC. c KSEA en el grupo de sustratos Módulo 1, MsigDB y PTMsigDB. d La segunda subred de PPI con la puntuación más alta, llamada Módulo 2, se identificó en el enriquecimiento de pTyr de corazón completo con R403Q-αMyHC y se comparó con TgErbB2. e KSEA en el grupo de sustratos del Módulo 2 muestra quinasas activadas en R403Q-αMyHC. Los resultados del análisis de PTMsigDB y MSigDB identificaron EGFR1, citoesqueleto de actina, ERBB y señalización de adhesión focal. Cada nodo es una fosfoproteína representada por su péptido más significativo en los módulos PPI. El color del nodo se basa en el cambio de pliegue de Log2 en relación con NTG. La escala está marcada por FC y una barra coloreada de azul a rojo.

El análisis de vías convencional puede pasar por alto grupos de proteínas porque los algoritmos de vías están predefinidos y son rígidos. Un enfoque de red de interacción proteína-proteína (PPI) podría capturar mejor las respuestas de señalización en estos modelos que normalmente no se detectan mediante el análisis de vías. Para hacerlo, se empleó MoBaS Analysis22,31 para identificar subredes densamente conectadas que están relacionadas y podrían exhibir fosforilación diferencial en modelos Tg. Se identificaron varios módulos, y nos enfocamos en los dos principales módulos de PPI estadísticamente significativos del conjunto de datos global de flujo de TMT de corazón completo; para fines de interpretación, se designaron como Módulo 1 y Módulo 2. Los sustratos de los módulos 1 y 2 se ilustran en la Fig. 6b, d, respectivamente.

Curiosamente, el análisis de firmas moleculares a nivel de sitio de PTMsigDB mostró que el módulo 1 contenía modificaciones específicas de sitio significativas para la vía EGFR1. Además, mediante el análisis del nivel de proteína del gen MSigDB, varias vías, como la señalización de ErbB, PDGFRA y las vías de adhesión focal, mostraron significación estadística. KSEA de la red proteína-proteína del módulo 1 destaca la activación significativa de AURKB (aurora quinasa B) y CSNK2A1 (Fig. 6c).

De manera similar, el análisis de PTMSigDB para el módulo 2 confirmó la participación de EGFR1 Pathway, mientras que MsigDB detectó el citoesqueleto de actina, la señalización de ErbB y las vías de adhesión focal. KSEA de la red proteína-proteína del módulo 2 destaca la activación significativa de SRC, MAP2K1, HCK, LCK, SYK, JAK3, JAK2, FYN, PTK6 y ABL1 en ratones R403Q-αMyHC (Fig. 6e). Estos datos confirman que MoBAS identificó módulos funcionalmente relevantes de PPI entre los péptidos pTyr identificados, y PTMsigDB apuntó a EFGR1 Pathway como una vía común para HCM de dos modelos de ratón no relacionados.

Los corazones de ratón TgErbB2 desarrollan un tipo concéntrico de HCM. Esta alteración progresa rápidamente a MCH patológica, mostrando características como fibrosis, desorden de cardiomiocitos, manipulación alterada de Ca2+, arritmias y muerte súbita16. Por estos motivos, planteamos la hipótesis de que al contrarrestar farmacológicamente la actividad de la sobreexpresión cardíaca de ErbB2, un receptor de tirosina quinasa, utilizando AG-825 (un inhibidor de ErbB2), detendría la progresión del fenotipo histopatológico. Para ello, ratones TgErbB2 (de 6 a 9 meses de edad) con controles establecidos de MCH y Ntg fueron tratados con vehículo AG-825 o DMSO durante dos semanas, por vía subcutánea dos veces al día a una dosis de 1 mg/Kg16. A continuación, se evaluó la fibrosis miocárdica mediante tinción tricrómica de Masson. Los ratones TgErbB2 no tratados desarrollaron cantidades variables de fibrosis del ventrículo izquierdo (Fig. 7a, b); sin embargo, los ratones tratados con TgErbB2 mostraron menos fibrosis (Fig. 7b). Por el contrario, la histología cardíaca no se vio afectada por el tratamiento con AG-825 en ratones Ntg. Utilizamos CytoSpectre32, una interfaz gráfica de usuario web, para caracterizar los efectos de AG-825 en el desorden de los cardiomiocitos; esta interfase determina la orientación local de las estructuras, incluidos los miocitos cardíacos, a través de cortes histológicos, similar al análisis descrito previamente por el laboratorio de Seidman33. Las regiones de interés elegidas al azar se representan en la Fig. 7a y aumentan la ampliación de las microfotografías de 5X a 40X (Fig. 7b). Se evaluó la varianza del ángulo de orientación de los miocitos, denominada varianza circular y varianza media de los ángulos de orientación. Ntg tratado con el vehículo (Fig. 7c) en comparación con Ntg AG-825 tratado (Fig. 7c) no fue significativamente diferente (Fig. 7d), como ya se describió33. Por el contrario, los cardiomiocitos de ratones TgErbB2 tratados con el vehículo mostraron una variación del ángulo de orientación que era sustancialmente diferente del control Ntg-Vehicle; vea la forma heterogénea y más amplia del gráfico de orientación en la Fig. 7c. Sorprendentemente, los cardiomiocitos de los ratones TgErbB2 tratados con AG-825 mostraron un desorden significativamente menor, como lo demuestra el retorno significativo de la varianza circular y la forma de la gráfica a los controles tratados con Ntg-Vehículo o AG-825 (Fig. 7e, p = 0.0014 por One- manera ANOVA). Este análisis sugiere que los cardiomiocitos de los ratones TgErbB2 tratados con AG-825 mostraron un desorden de miocitos significativamente menor, como lo indica la varianza circular reducida.

a Secciones teñidas con tricrómico de Masson (5X) de ratones Ntg tratados con vehículo y Ntg tratados con AG-825 y TgErbB2 tratados con vehículo y TgErbB2 tratados con AG-825, las puntas de flecha amarillas apuntan a áreas fibróticas. Barra de escala 1 mm. b Las secciones teñidas con tricrómico de Masson (40X) de regiones representativas de interés muestran un aumento de la fibrosis en el miocardio de ratones TgErbB2, que la fibrosis mejoró después de 2 semanas de tratamiento con AG-825. Se usaron las mismas áreas para determinar el nivel de desorden de miocitos cardíacos, que se logró analizando la orientación celular usando el software CytoSpectre de Vehicle y secciones de corazón de ratón Ntg y TgErbB2 tratadas con AG-825 (barra de escala de 50 μm). c Gráficos de la distribución de los ángulos de orientación de las células cardíacas. Observe cómo los ángulos de Ntg son homogéneos y no cambiaron en el grupo tratado con AG-825. Por el contrario, la Tg tratada con vehículo mostró ángulos de orientación diferentes y menos homogéneos, lo que confirma el desorden de los cardiomiocitos. El tratamiento con AG-825 reduce el desorden de los cardiomiocitos, y el gráfico de orientación es similar al del grupo de NTG tratado con AG-825. d Ángulo de orientación medio de los miocitos cardíacos, y e Varianza circular, otra medida de isotropía, en ratones Ntg y TgErbB2 con y sin tratamiento con AG-825 (n = 5 animales por condición). Las barras del gráfico se expresan como media ± sem; Se realizó una prueba ANOVA unidireccional para comparaciones estadísticas que mostraron una mejora significativa en ratones TgErbB2 tratados con AG-825 (valor p < 0,0014). f La ecocardiografía cardíaca de los cuatro grupos muestra que el tratamiento con AG-825 durante 14 días no modificó la función contráctil, estimada como % de fracción de acortamiento.

A continuación, evaluamos el impacto directo in vivo de la inhibición de ErbB2 por AG-825 en la contractilidad, los ecocardiogramas y las imágenes doppler tisulares para evaluar la función diastólica. Estos estudios se realizaron en ratones conscientes (no anestesiados), al inicio del estudio y después de dos semanas de tratamiento. Utilizamos un sistema de imágenes de alta resolución Vevo 2100 con un transductor de 40 MHz (VisualSonics®, Toronto). Los datos se analizaron posteriormente con un paquete de software cardiovascular avanzado. Los parámetros estudiados fueron las dimensiones de la cámara, el acortamiento fraccional, la fracción de eyección y la dinámica de la velocidad del Doppler tisular. Los datos funcionales del ventrículo izquierdo obtenidos mediante imágenes ecocardiográficas de eje corto paraesternal no determinaron cambios significativos en el acortamiento fraccional medio a lo largo del tiempo en ratones TgErbB2 tratados con solución de vehículo en comparación con Ntg (Fig. 7f). De manera similar, los ratones TgErbB2 tratados con AG-825 no mostraron cambios significativos en la función contráctil a lo largo del tiempo en comparación con los tratados con Ntg AG-825 (Fig. 7f). El Doppler tisular no detectó diferencias significativas en la función diastólica; consulte los datos completos de ecocardiografía en Datos complementarios 6. Estos datos sugieren que la inhibición farmacológica de ErbB2 detuvo o revirtió la remodelación patológica al reducir la respuesta fibrótica y restaurar la alineación de los cardiomiocitos. Sin embargo, esta respuesta no fue paralela a la preservación in vivo de la función contráctil del VI en ratones TgErbB2.

Revisamos la fosfoproteómica de TgErbB2 y NTg para validar los hallazgos bioinformáticos de KSEA y estudiar el impacto del inhibidor de tirosina quinasa AG-825 en el proteoma. Utilizamos un enfoque de etiquetado TMT 13-plex para comparar el perfil de fosforilación de todo el corazón de ratones Ntg y TgErbB2 tratados con vehículo o AG-825 (inhibidor de ErbB2). Brevemente, se realizó un TMT 13-plex de la siguiente manera; Ntg-Vehicle (n = 3), tratamiento Ntg-AG-825 (n = 3), TgErbB2-Vehicle (n = 3) y tratamiento TgErbB2-AG-825 (n = 4). Se aislaron lisados ​​de proteínas de corazón completo de corazones estabilizados térmicamente y se procesaron como se describe en la Fig. 2 y "Material y métodos". La mayor parte del material se usó para enriquecer los péptidos pS/pT/pY, y una pequeña porción se marcó para cuantificar el proteoma completo con TMT. Como se describe en el experimento anterior en la Fig. 2, la intensidad de los péptidos pS/pT/pY se normaliza a la intensidad de las señales TMT del proteoma completo. Se cuantificaron un total de 6614 proteínas, 4732 péptidos de serina y treonina fosforilados y 346 péptidos pTyr mediante iones indicadores TMT. El conjunto de datos completo está disponible en Datos complementarios 7.

Los mapas de calor de intensidad de péptidos fosforilados de tirosina o serina/treonina normalizados agrupados jerárquicamente hacia arriba o hacia abajo confirman la influencia del genotipo en toda la remodelación del fosfoproteoma, la fosforilación de serina y treonina (Fig. 8a) y pTyr (Fig. 8b). Interrogamos directamente los datos con MSigDB y PTMSigDB para comparar Ntg con ratones TgErbB2. Como se anticipó, confirmamos la participación de EGFR1 Pathway por PTMSigDB en la hipertrofia cardíaca de ratones TgErbB2 tratados con vehículo (Fig. 8c, d) o AG-825 (Fig. 8e, f). Además, confirmamos la participación de las vías de adhesión focal y matriz extracelular por MSigDB en ratones tratados con vehículo y miocardiopatía dilatada, HCM y miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho (ARCV) en ratones tratados con AG-825. Sin embargo, el tratamiento con AG-825 durante 14 días tuvo un efecto sutil en ratones TgErbB2 que no fue evidente por MsigDB o PTMsigDB. Dado que incluimos todos los fosfoproteomas, estimamos la actividad de la quinasa en el péptido de fosforilación de serina y treonina. Las quinasas superiores reguladas al alza y a la baja se identificaron utilizando KSEA, y el resultado se presenta en la Fig. 8g. El análisis completo de KSEA y ruta está disponible en Datos complementarios 5 y Datos complementarios 7. Comparamos la actividad de las quinasas en animales tratados con AG-825 en relación con su control (tratamiento con vehículo). Identificamos un pequeño grupo de quinasas significativamente inhibidas o reguladas a la baja por el tratamiento AG-825 y no por el tratamiento con vehículo (consulte el rectángulo rojo resaltado en la Fig. 8g). Para obtener más información sobre el impacto funcional desde el punto de vista de la biología del sistema, exploramos la relación de estas quinasas utilizando el software de visualización The Signaling Network Open Resource (Signor 2.0)34. La Figura 8h muestra que la mayoría de estas quinasas están aguas abajo de EGFR, resaltadas en círculos de puntos azules. En conjunto, nuestros datos indican que EGFR1 es fundamental para la hipertrofia de TgErbB2 y que el tratamiento con AG-825 inhibe ErbB2 y EGFR; por lo tanto, se ve afectado un subconjunto significativo de objetivos aguas abajo de la cascada de señalización de EGFR.

a Se utilizó un mapa de calor para visualizar el agrupamiento jerárquico no supervisado de péptidos Ser/Thr, y b Los péptidos de ptirosina se normalizaron a la expresión completa del proteoma con un valor de p < 0,05 mediante ANOVA. Sobrerrepresentado (amarillo) y subrepresentado (Azul). c Gráficas de volcán que muestran el cambio de veces de Log2 y el valor de p -Log10 de cada péptido pSer/pThr y d péptidos pTyr en la comparación por pares de Ntg y TgErbB2 después de dos semanas de tratamiento con vehículo. e Gráficos de volcán que muestran el cambio de pliegue Log2 y el valor p -Log10 de cada péptido pSer/pThr y f péptidos pTyr en la comparación por pares de Ntg y TgErbB2 después de dos semanas de tratamiento con AG-825, (g) KSEA se muestra en rojo rectángulo las quinasas significativamente inhibidas por AG-825. KSEA y Pathway Enrichment Analysis del análisis combinado de datos de fosforilación de Ser/Thr/Tyr usando PTMSigDB confirman que EGFR1 Pathway está significativamente involucrado. h El análisis Signaling Network Open Resource (Signor 2.0) muestra que nueve quinasas están involucradas en la vía EGFR. Las quinasas encontradas en la red y también en KSEA están rodeadas de círculos azules punteados. El código de símbolo de la red se muestra junto a la ruta.

El presente estudio demuestra que el proteoma pTyr del corazón está alterado en proteínas relacionadas con miocardiopatías, serina/treonina y tirosina quinasas en dos modelos patogenéticamente no relacionados de miocardiopatía por hipertrofia (MCH), a saber, la sobreexpresión cardíaca específica de ErbB2 y la expresión alélica de R403Q-αMyHC. Además, el fosfoproteoma de serina/treonina del corazón también está alterado en el modelo de hipertrofia cardíaca del ratón TgErbB2. En conjunto, nuestros datos apuntan a que la activación de la vía EGFR está involucrada centralmente en la hipertrofia cardíaca que surge de dos modelos de ratón muy diferentes.

La disfunción contráctil de la insuficiencia cardíaca se debe, en parte, a la desensibilización del miofilamento al Ca2+. La fosforilación alterada de serina/treonina del sarcómero cardíaco y la reducción de la sensibilidad al Ca2+ de los miofilamentos son características de modelos humanos y experimentales de insuficiencia cardíaca y juegan un papel en la fisiopatología de la MCH y la MCD7,35,36. Anteriormente identificamos pTyr en la troponina cardíaca humana I Y26 que estaba regulada a la baja en la insuficiencia cardíaca humana y DCM14. Sin embargo, ningún estudio ha abordado aún el impacto de la pTyr cardíaca desregulada globalmente en la patogenia de la enfermedad cardíaca.

Aquí, mostramos evidencia de que en el corazón de ratones TgErbB2, el fosfoproteoma de tirosina se altera de manera diferencial, regulación al alza y regulación a la baja de los fosfopéptidos de tirosina. El análisis de la ruta de MsigDB demostró la participación de ARVC, HCM, DCM y la señalización de integrina alfaIIB beta3 en corazones de ratones TgErbB2. La mayoría de las proteínas del sarcómero tenían una regulación a la baja significativa de pTyr, como Myh7-Y386, Y410, Y1375, Myh6-Y1349 y Ttn-Y2118, Y21190, excepto Ttn-Y31324 que estaba regulada al alza. El cambio direccional de pTyr en estas proteínas del sarcómero es una regulación a la baja, tal como se informó para la cTnI Y26 humana en la insuficiencia cardíaca y la DCM. Se sabe muy poco sobre el papel de pTyr en las proteínas del sarcómero. De hecho, solo un grupo37 ha examinado las tirosina quinasas potenciales que fosforilan la cTnI. Demostraron in vitro que c-Src y otro miembro de la familia de quinasas Src, Lyn, fosforila el cTnIY26, informando que la fosforilación y la pseudofosforilación imitan en este sitio la sensibilidad reducida de los miofilamentos al Ca2+, como lo demuestra la respuesta alterada de fuerza-calcio de los miofilamentos. Cabe destacar que la fosforilación de cTnI Y113, un nuevo sitio descubierto, se reguló a la baja en ratones R403Q-αMyHC. También demostramos una regulación a la baja significativa de pTyr en Ttn-Y1881, Y1902 e Y33864. A diferencia de los ratones TgErbB2, Myh7-Y410 se reguló positivamente en los ratones R403Q-αMyHC. pTyr en Myh7-410 está cerca de R403Q αMyHC y podría tener un impacto funcional ya que se encuentra en la cabeza del dominio motor de αMyHC. Las implicaciones específicas del sitio de estos cambios merecen más estudio; sin embargo, está más allá del alcance del presente trabajo. Curiosamente, en los corazones R403Q-αMyHC, el proteoma pTyr también se altera de manera diferente. Sin embargo, en ratones R403Q-αMyHC, más péptidos de fosfotirosina alcanzaron significación estadística. A diferencia de TgErbB2, el análisis de la vía MsigDB demostró que los ratones R403Q-αMyHC tenían alteraciones en las vías del receptor de tirosina quinasa, el receptor de angiopoyetina, ErbB y la señalización del receptor de la hormona del crecimiento. Mientras que PTMsigDB reveló la alteración de la vía EGFR1 y el carcinoma de células escamosas. Pensamos que la sobreexpresión de un receptor tirosina quinasa en corazones de ratones TgErbB2 daría como resultado una alteración más significativa del proteoma pTyr. Sin embargo, los datos sugieren que una sola mutación puntual del sarcómero, como en el caso de los ratones R403Q-αMyHC, es lo suficientemente incisiva como para alterar significativamente el proteoma cardíaco pTyr. La proteómica de arriba hacia abajo38 demostró que las alteraciones constantes de cTnI, ENH2 y otra fosforilación de la proteína del disco Z en el miocardio de la MCH se correlacionaron mejor con el fenotipo, independientemente de la mutación causante de la enfermedad del punto único del sarcómero. Se desconocen los mecanismos por los que una mutación patogénica en la cadena pesada de la miosina (R403Q-αMyHC) puede afectar la regulación de pTyr y justifican una mayor investigación.

La desregulación global de pTyr en el modelo de ratón TgErbB2 es esencial porque conecta la hipertrofia cardíaca pronunciada, la disfunción del sarcómero y el manejo anormal del calcio16 con alteraciones en las vías de la tirosina quinasa. Por otra parte, la inhibición farmacológica de ErbB2 (HER2/neu) con el inhibidor lapatinib en pacientes con cáncer de mama tratadas con doxorrubicina aumenta el riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca en comparación con las pacientes tratadas con doxorrubicina sola39. Sugiere que mantener la homeostasis de pTyr puede ser necesario para regular la función y la homeostasis de los cardiomiocitos.

En este estudio con pTyr se identificó una amplia variedad de otros objetivos funcionalmente relevantes, desde proteínas de sarcómero hasta disco z, filamentos intermedios (como la desmina), componentes de desmosoma, proteínas de unión de adherencia y adhesión focal, receptores de membrana, quinasas y fosfatasas. . Por ejemplo, se observó pTyr en varias proteínas asociadas al disco z (para obtener una lista completa, consulte los Datos complementarios 2, 3 y 6). Las proteínas del disco Z son cruciales para la contracción muscular y el estrés mecánico, el crecimiento y la señalización metabólica40. Además, la alteración en los niveles de fosforilación del péptido Pkp2-Y119 de la proteína placofilina-2 (Pkp2) del componente clave del desmosoma se observó en ambos modelos de ratón, regulación al alza en R403Q-αMyHC Tg y regulación a la baja en TgErbB2. Se desconoce el efecto funcional de la regulación positiva o negativa de la fosforilación de Pkp2-Y119. Sin embargo, la deleción homocigótica de Pkp2 altera la arquitectura del corazón y es letal en el embrión41. En el corazón, se requiere Pkp2 para ensamblar el desmosoma y la actividad de PKC42. Las mutaciones autosómicas dominantes en este gen son responsables del 25 al 50% de las ARVC. Curiosamente, los ratones TgErbB2 tienen una mayor susceptibilidad a las arritmias y al desorden miofibrilar16, similar a los pacientes con mutaciones de miosina y MCH. Los cambios en la fosforilación de Pkp-Y119 podrían afectar el fenotipo.

La vía EGFR1 (ErbB1) juega un papel central en la hipertrofia cardíaca en ambos modelos Tg. La inhibición farmacológica de EGFR, usando AG-1478, protege contra la hipertrofia cardíaca inducida por angiotensina II in vitro e in vivo43. La hipertrofia concéntrica asociada con la sobreexpresión cardíaca específica de ErbB2 se puede revertir mediante la administración temprana de Lapatinib, que inhibe el receptor de tirosina quinasa12 de EGFR además de ErbB2. En este estudio, el bloqueo farmacológico del receptor ErbB2 por AG-825 en ratones adultos TgErbB2 redujo el desorden de los miocitos pero no preservó la función cardíaca ni alteró la hipertrofia cardíaca. Creemos que la falta de respuesta está relacionada con la edad de los ratones en el momento de la administración: en el estudio actual, utilizamos ratones adultos, mientras que en estudios anteriores se utilizaron cachorros15. También evaluamos la serina/treonina cardíaca y el proteoma pTyr en TgErbB2 después del tratamiento con vehículo o AG-825. Encontramos alteraciones globales en el fosfoproteoma (fig. 8) que confirmaron la implicación de la vía EGFR. Además, confirmamos las alteraciones en las vías de adhesión focal, matriz extracelular, DCM, HCM y ARCV. Usamos KSEA para emparejar los hallazgos con un subconjunto de quinasas activadas y reducirlo a las 40 serina/treonina y tirosina quinasas más representativas detectadas en el proteoma cardíaco de ratones Ntg y TgErbB2. El tratamiento con AG-825 podría inhibir o reducir significativamente la activación de 14 quinasas correspondientes a la vía EGFR (Fig. 8g, h), lo que sugiere que el tratamiento con AG-825 fue eficaz y específico. En conjunto, estos hallazgos indican que las alteraciones del proteoma cardíaco se extienden a serina/treonina y pTyr, lo que confirma la participación de las vías descritas anteriormente. Además, estos datos sugieren que los cambios inducidos por el tratamiento con AG-825 en el fosfoproteoma se correlacionaron con una mejora en el desorden de los miocitos cardíacos.

El KSEA implicó una marcada regulación a la baja de los miembros de la vía MAPK canónica aguas abajo de k-Ras en ratones TgErbB2. Por el contrario, en ratones R403Q-αMyHC, observamos una regulación positiva de la adhesión focal y las vías de señalización de PDGFR-beta (SRC, LYN, LCK, JAK2, INSR, MAPK1 y HCK). Más importante aún, el análisis de puntuación de base modular (MoBas) identificó subredes de interacción proteína-proteína enriquecidas en ErbB, PDGFRA y vías de adhesión focal y activación de aurora quinasa B y CSNKA1. Estos datos indican que muchas dianas se superponen en ambos modelos transgénicos de hipertrofia cardíaca. Aunque existen marcadas diferencias en los reguladores aguas arriba de ErbB2 y la cadena pesada de miosina, muchas moléculas efectoras aguas abajo son comunes y pueden ser el objetivo de los inhibidores de molécula pequeña (diseñados inicialmente para tratar varios tipos de cáncer) para bloquear la hipertrofia cardíaca.

La vía MAPK está involucrada en la respuesta adaptativa y desadaptativa que podría conducir a la hipertrofia cardíaca (para revisión44). La vía de señalización RAS-RAF-MEK-ERK es un objetivo atractivo para la intervención terapéutica en oncología. Se han probado varios inhibidores selectivos de moléculas pequeñas de RAF y MEK en ensayos clínicos45. El presente estudio encontró una mayor fosforilación en MAPK1-Y185, que activa la quinasa en R403Q-αMyHC, y la actividad de MAPK1 se relaciona directamente con la hipertrofia cardíaca46. La c-Src, la quinasa central de su familia, podría ser uno de los reguladores potenciales de los cambios del proteoma pTyr observados en R403Q-αMyHC porque fosforila el receptor EGFR aguas arriba y fosforila Stat, entre otros objetivos, aguas abajo. c-Src afecta la respuesta al estiramiento mecánico de los cardiomiocitos al desencadenar una cascada de señalización intracelular en los cardiomiocitos hacia una respuesta hipertrófica47,48. Además, c-Src fosforila PXN-Y11849, y este sitio tuvo un aumento de 25 veces en la fosforilación en ratones R403Q-αMyHC. Curiosamente, c-Src media la activación de MAPK1 y MAPK3 en respuesta a la sobrecarga de presión47. En particular, un estudio anterior ha demostrado que la hipertrofia cardíaca inducida por sobrecarga de presión se exacerba en ratones R403-αMyHC Tg50, lo que sugiere que el mecanismo por el cual la mutación R403-αMyHC produce hipertrofia cardíaca es sensibilizando las células a la señalización inducida por sobrecarga de presión a través de c -Origen

Los ratones R403Q-αMyHC mostraron una fosforilación mejorada de JAK2, STAT5A y STAT5B en los sitios de activación (Y570, Y694 y Y699, respectivamente), lo que indica no solo la activación de la señalización de MAPK sino también la activación de la señalización de JAK-STAT. Señalización de Jak-Stat: la vía IL-6 se activa en respuesta a la familia de citocinas IL-6 (IL-6, cardiotrofina 1 y factor inhibidor de la leucemia), interfiere con la vía EGFR y está involucrada en la hipertrofia cardíaca. Esta vía tiene efectos cardioprotectores, pero la activación crónica puede provocar hipertrofia cardíaca (revisado en la ref. 44). Vakrou y sus colegas realizaron un análisis de vías en los perfiles de miARN de R403Q-αMyHC. Estos autores encontraron similitudes con los hallazgos descritos en este trabajo, como la sobreactivación de la señalización de quimiocinas (CXCR4), el citoesqueleto de actina y las vías de señalización de la hipertrofia cardíaca51. Estos resultados sugieren una participación esencial de la regulación de pTyr en miofilamentos y otras proteínas cardíacas. La información obtenida de estos estudios podría informar nuevos enfoques terapéuticos en la MCH relacionada con la mutación del sarcómero y potencialmente en otras afecciones asociadas con la MCH. Los estudios se limitaron a dos modelos de ratones transgénicos que desarrollan hipertrofia cardíaca; podrían explorarse y compararse otros modelos de mutaciones del sarcómero o sobrecarga de presión, como la banda aórtica. Es posible que se pasen por alto algunos sitios relevantes de fosforilación de tirosina debido a su baja estequiometría y desafíos técnicos. Este problema es particularmente cierto para las proteínas unidas a la membrana, que son difíciles de evaluar en estudios fosfoproteómicos.

Este estudio revela que los patrones de pTyr alterados son sorprendentes en dos modelos separados de HCM. Además, a pesar de algunos sitios compartidos, formas etiológicamente diferentes de MCH pueden albergar firmas pTyr específicas que señalan la vía EGFR como central en ambos modelos transgénicos. Esta evidencia, combinada con la inhibición de un receptor tirosina quinasa específico usando tyrphostin AG-825, puede revertir el desorden de los cardiomiocitos y racionalizar los enfoques para manipular el proteoma pTyr como un enfoque terapéutico para la MCH. Además, estos estudios indican que los inhibidores de la tirosina quinasa, que ahora se usan ampliamente en las terapias contra el cáncer, pueden cambiar la función cardíaca al modificar directamente los perfiles de tirosina quinasa y serina/treonina quinasa del corazón.

Los lisados ​​​​de corazón completo de tejido estabilizado por calor se resuspendieron en tampón SDS al 1%, se separaron 10–15 μg mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con BSA al 5 % en tampón TBS-T (20 mmol/L Tris pH 7,4, 150 mmol/L NaCl y 0,1 % Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente, luego se incubaron con una dilución de anticuerpo primario 1:1000 en BSA-TBS-T al 1%; mAb de ratón con fosfotirosina (pTyr-100, n.° de cat. 9411SCST), Ab de conejo TnI (n.° de cat. 4002SCTS), Ab de conejo Src (n.° de cat. 2108SCST), mAb de conejo de la familia Phopsho-Src (Tyr416) ​​(D49G4) , n.º de cat. 6943T CST), GAPDH Rabbit Ab (14C10, n.º de cat. 2118S CST) a 4 °C durante la noche. Después de lavarlos cinco veces, los anticuerpos secundarios se diluyeron 1:10.000 en BSA-TBS-T al 1 % (anti-Rabbit IgG-HRP linked (cat. No. 7074S CTS), Anti-Mouse m-IgGk BP-HRP (cat. .No. sc-516102, Santa Cruz) e incubadas durante 1 h a temperatura ambiente, luego las membranas se revelaron con Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo), y las bandas inmunorreactivas se detectaron por quimioluminiscencia con un iBright 1500 (Invitrogen Las imágenes se obtuvieron y analizaron con el software Image J. Se utilizó ANOVA unidireccional para comparar grupos y determinar la significación estadística.

Todos los protocolos se realizaron siguiendo la "Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio" publicada por los Institutos Nacionales de Salud y la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los ratones TgErbB2 (tinción B6SJLF1/J) y R403Q-αMyHC (C57/Bl6) se obtuvieron del Dr. K. Gabrielson y el Dr. LA Leinwand, respectivamente16,17, para establecer colonias de reproducción. Se anestesiaron ratones machos o hembras (6-9 meses) con sobredosis de pentobarbital sódico IP (75 mg/kg) o isoflurano (5%); los corazones se diseccionaron rápidamente, seguido de estabilización térmica (Denator T1 Heat Stabilizor, Suecia) y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Se procesaron en paralelo corazones de ratones TgErbB2 y R403Q-αMyHC (n = 5 por grupo). Para obtener lisados ​​cardíacos completos, los ventrículos cardíacos (~200 mg) se homogeneizaron en tampón enfriado con hielo: HEPES 20 mM, pH 7,6, pirofosfato de sodio 1 mM, 1,5 mM, PhosStop y urea 9 M a 10 μl/mg (peso húmedo de tejido). El homogeneizado se enfrió en hielo, seguido de una breve sonicación con micropunta en hielo, centrifugación a 10 000 × g durante 15 min a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry (Bio-Rad).

La proteína de los lisados ​​cardíacos se redujo en ditiotreitol (DTT) 5 mM a 60 °C durante 20 min y se alquiló en yodoacetamida (IDA) 10 mM a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. Cada muestra (30 mg por ratón, n = 5 ratones por genotipo) se digirió con tripsina de grado proteómico (Promega) en una proporción de 1:200 en urea 2 M, tampón HEPES 20 mM, pH 8,0 a temperatura ambiente durante la noche. La digestión se terminó con ácido trifluoroacético (TFA al 1%). Las muestras se centrifugaron (5 min a 1800 g) y los sobrenadantes se desalinizaron mediante extracción en fase sólida (cartucho SepPak C18 de 10 cc, Waters). Los eluidos se liofilizaron durante tres días a -20 °C.

Se agruparon un total de 150 mg de péptidos tripsinizados por genotipo y se enriquecieron en ptirosina, como se describió previamente52. Los péptidos liofilizados se mezclaron en 1,4 ml de tampón de inmunoprecipitación (tampón IAP MOPS 50 mM, pH 7,2, fosfato sódico 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0). Una solución madre de perlas de proteína agarosa G (Santa Cruz Biotechnology) 80 μL de suspensión se conjugaron con 300 μg de anticuerpo monoclonal de ratón fosfo-tirosina (p-Tyr-100, Cell Signaling Technology). El conjugado de perlas-anticuerpo anti-p-Tyr se transfirió al tubo del péptido y se incubó con rotación suave durante 2 horas a 4 °C. Las perlas se lavaron y eluyeron con 55 μl y 45 μl de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,15 %, respectivamente. Se combinaron los dos rendimientos de elución. Las mezclas de péptidos resultantes se purificaron mediante extracción en fase sólida (puntas de etapa C18, Thermo Scientific). Las muestras se secaron por centrifugación al vacío. Este enfoque se repitió tres veces con muestras de los tres grupos en paralelo, 15 corazones por genotipo en tres repeticiones técnicas. El flujo continuo del tampón de inmunoprecipitación se almacenó a -80 °C para el subsiguiente TMT 9-plex. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, los péptidos trípticos se desalinizaron y marcaron con TMT isobárica de 9 plex (Thermo Scientific). La reacción de marcaje se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de inactivación con Tris.HCl 100 mM (pH 8,0).

Los fosfopéptidos se disolvieron en 10 μl de TFA al 0,1 %, ACN al 2 % (v/v) seguido de análisis RF-HPLC-ESI-MS/MS. Los fosfopéptidos se separaron en una columna de fase inversa C18 con un gradiente lineal de acetonitrilo (4-40 %) durante 120 min y luego se analizaron en un LTQ-Orbitrap Elite MS (ThermoFisher Scientific) con HCD activado por pérdida de neutro.

Los datos de MS sin procesar se buscaron con Mascot 2.3, y la cuantificación sin etiquetas con cromatogramas de iones extraídos de MS1 se realizó utilizando el software MaxQuant.

Los péptidos se analizaron en Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific) junto con el sistema de cromatografía líquida Easy-nanoLC 1200 nanoflow (Thermo Scientific). Los péptidos de cada fracción se reconstituyeron en ácido fórmico al 10 % y se cargaron en la columna Acclaim PepMap100 Nano Trap (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) empaquetada con partículas C18 de 5 μm a un caudal de 5 μl por minuto. Los péptidos se resolvieron a una velocidad de flujo de 250 nl/min usando un gradiente lineal de 10 a 35 % de solvente B (0,1 % de ácido fórmico en 95 % de acetonitrilo) durante 120 min en la columna EASY-Spray (50 cm × 75 µm ID, PepMap RSLC C18 y partículas C18 de 2 µm) (Thermo Scientific). Se instaló en una fuente de iones EASY-Spray que funcionaba con un voltaje de 2,0 kV. El análisis de espectrometría de masas se llevó a cabo en función de los datos con barridos completos de m/z 350 a 1500. Tanto MS como MS/MS se adquirieron y midieron utilizando el analizador de masas Orbitrap. Los escaneos completos de MS se midieron a una resolución de 120 000 a m/z 200. Los iones precursores se fragmentaron usando un método de disociación colisional de mayor energía (35) y se detectaron a una resolución de masa de 30 000 a m/z 200. Se usó Proteome Discoverer 2.4 para identificación y cuantificación contra uniport_mouse_120119_UP000000589. Los parámetros de búsqueda utilizados son los siguientes: (a) tripsina (hasta dos clivajes perdidos), (b) longitud mínima de aminoácidos: 6, (c) péptidos mínimos para proteína: 1, (d) Modificaciones fijas TMT6plex en cualquier N- terminal y residuo de lisis, carbamidometilación de cisteína, (e) modificaciones dinámicas: oxidación en metionina, acetilo en N-terminal, pérdida de Met en M y pérdida de Met +acetilo en M y (f) tasa de descubrimiento falso del 1 % para péptido y proteína niveles

Las preparaciones enriquecidas con miofilamentos se obtuvieron enjuagando corazones recién aislados en PBS enfriado con hielo (inhibidores de proteinasa Roche 1X y PhosStop 1X, Roche), se extrajo tejido auricular y se picó tejido ventricular en tampón estándar enfriado con hielo (KCl 60 mM, imidazol 30 mM, pH 7,0). , MgCl2 2 mM, Inhibidores de Proteinasa Roche 1X y PhosStop 1X de Roche). Los tejidos ventriculares se homogeneizaron con un homogeneizador (Omni tejido homogenizer TH) a máxima velocidad durante 2-3 pulsos de 10 segundos con la solución en hielo, centrifugada a 12.000 g durante 15 min. Los gránulos de miofilamento se resuspendieron en una solución de decapado (EGTA 10 mK, MgCl2 8,2 mM, KCl 14,4 mM, imidazol 60 mM, pH 7,0, ATP 5,5 mM, fosfato de creatina 12 mM, creatina fosfocinasa 10 U/ml, Triton 100X al 1 %, inhibidores de proteinasa Roche 1X y PhosStop 1X de Roche) y se incubaron en hielo durante 30 min28. Los sedimentos de miofilamento se centrifugaron a 1100 g durante 15 min y se lavaron en el tampón estándar. Los sedimentos de miofilamentos recién aislados se diluyeron en tampón estándar y se cuantificaron con el ensayo de Lowery. Las proteínas de miofilamento (~7 mg) de cada corazón de ratón se resuspendieron en urea 8 M y bicarbonato de trietilamonio (TEAB) 50 mM (Sigma), seguido de reducción con ditiotreitol 10 mM (Sigma) a temperatura ambiente durante 1 h y alquilación con yodoacetamida 30 mM (Sigma) durante 20 min en la oscuridad, ver Fig. 4a–d. A continuación, las muestras de proteína se digirieron durante la noche a 37 °C utilizando tripsina de grado de secuenciación (1:50) (Promega). Los péptidos trípticos se desalinizaron y marcaron con etiquetas de masa en tándem (TMT) isobáricas de 6 plex (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de marcaje se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de inactivación con Tris.HCl 100 mM (pH 8,0). Los péptidos digeridos y marcados se agruparon y desalinizaron con C18 SEP-PAK (Waters), seguido de enriquecimiento con ptirsoína utilizando el kit PTMScan® Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) (Cell Signaling Technology), véase la Fig. 4c. Brevemente, los péptidos desalados se reconstituyeron en 1,4 ml de tampón de purificación por inmunoafinidad (IP) que contenía MOPS 50 mM pH 7,2, fosfato sódico 10 mM, NaCl 50 mM. El anticuerpo anti-fosfotirosina (p-Tyr-1000, Cell Signaling Technology) se mezcló con solución de péptido y se incubó en un rotador a 4 °C durante 2 h. Después de la incubación, las perlas se lavaron con tampón IP y agua dos y tres veces, respectivamente. Los péptidos de fosfotirosina se eluyeron utilizando TFA al 0,1%. Las muestras de péptido eluidas se desalinizaron con puntas C18 STAGE, se secaron al vacío y se mantuvieron a -80 °C antes del análisis LC-MS. A partir del flujo continuo, se realizó una cuantificación del proteoma completo para que sirviera como referencia para los hallazgos del proteoma pTyr.

Los péptidos de fosfotirosina y los péptidos no fosforilados se analizaron en Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific, San José, CA, EE. UU.) junto con el sistema de cromatografía líquida Easy-nanoLC 1200 nanoflow (Thermo Scientific). Los péptidos de cada fracción se reconstituyeron en ácido fórmico al 10 % y se cargaron en la columna Acclaim PepMap100 Nano Trap (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) empaquetada con partículas C18 de 5 μm a un caudal de 5 μl por minuto. Los péptidos se resolvieron a una velocidad de flujo de 250 nl/min usando un gradiente lineal de 10–35 % de solvente B (0,1 % de ácido fórmico en 95 % de acetonitrilo) durante 95 min en la columna EASY-Spray (50 cm × 75 µm DI, PepMap RSLC C18 y partículas C18 de 2 µm) (Thermo Scientific) y se ajustó a una fuente de iones EASY-Spray que funcionaba a un voltaje de 2,0 kV. El análisis de espectrometría de masas se llevó a cabo en función de los datos con barridos completos en el rango de m/z 350 a 1500. Tanto MS como MS/MS se adquirieron y midieron utilizando el analizador de masas Orbitrap. Los escaneos completos de MS se midieron a una resolución de 120 000 en m/z 200. Los iones precursores se fragmentaron utilizando un método de disociación por colisión de mayor energía y se detectaron a una resolución de masa de 30 000 en m/z 200.

MaxQuant 1.5 se utilizó para la cuantificación y la identificación frente a una base de datos RefSeq de ratón (versión 78) complementada con contaminantes observados con frecuencia. Los parámetros de búsqueda utilizados son los siguientes: (a) tripsina como enzima proteolítica (con hasta dos escisiones perdidas); (b) tolerancia al error de masa de péptido de 10 ppm; (c) tolerancia de error de masa de fragmento de 0,02 Da; ( d ) Carbamidometilación de cisteína (+57,02 Da) y etiquetas TMT (+229,16 Da) en el residuo de lisina y el extremo N del péptido como modificación fija y oxidación de metionina (+15,99 Da) y fosforilación de serina/treonina/tirosina (+79,96) Da) como modificaciones variables. Se permitieron dos clivajes perdidos y se habilitó la "coincidencia entre ejecuciones". Los péptidos y las proteínas se filtraron a una tasa de descubrimiento falso del 1 %. Las proteínas con un valor q inferior a 0,05 se considerarán expresadas diferencialmente con significación estadística.

La morfología y la función cardíacas se evaluaron mediante ecocardiografía transtorácica utilizando un sistema de alta resolución y alta frecuencia (Vevo 2100, VisualSonics, Canadá) equipado con una sonda de ultrasonido de 40 MHz en ratones conscientes22,53. La depilación torácica mecánica y química se realizó mediante afeitado y utilizando un agente depilatorio comercialmente disponible. La temperatura central, monitoreada a través de una sonda rectal, se mantuvo entre 36,5 y 37 °C con una lámpara calefactora. Las vistas del eje largo y corto paraesternal del corazón se capturaron en los modos B y M a velocidades de cuadro optimizadas. Diámetros internos telediastólicos (LVIDd, mm) y telesistólicos (LVIDs, mm) del VI, grosor de la pared telediastólica tanto del tabique interventricular (IVS, mm) como de la pared posterior del VI (LVPW, mm), fracciones de eyección del VI ( EF, %) y el acortamiento fraccional (FS, %) se midieron utilizando el modo M en la vista de eje largo. El grosor relativo de la pared (RWT), una medida de la hipertrofia, se calculó como IVSd+LVPWd/LVID. Se registraron registros de Doppler pulsado a la entrada mitral, salida del ventrículo izquierdo y tabique basal. Las imágenes digitales se almacenaron y analizaron fuera de línea utilizando el software Vevo LAB disponible comercialmente (VisualSonics, Canadá). Un técnico experimentado en ecocardiografía que desconocía los grupos experimentales realizó todas las mediciones.

La densidad de las bandas se midió con el software ImageJ y se calculó el área bajo la curva correspondiente a las bandas de pSRC, SRC, GAPDH, TnI y pTyr total. Luego, se calcularon las proporciones de pTyr/TnI, SRC/GAPDH, pSRC/GAPDH y pSRC/SRC y se compararon las proporciones entre los grupos usando ANOVA unidireccional.

Para caracterizar los efectos de AG-825 en el desorden de los cardiomiocitos, utilizamos la interfase del usuario gráfico web CytoSpectre32 para determinar la orientación local de los cardiomiocitos en las secciones histológicas. En regiones elegidas al azar, se calculó la varianza circular del ángulo de orientación medio de los miocitos. La comparación estadística entre grupos (Ntg+Vehículo, Ntg+AG825, TgErbB2+Veh, TgErbB2 + AG825) se realizó con ANOVA de una vía.

El análisis estadístico del conjunto de datos sin etiquetas se realizó con el software Perseus54. Se filtraron los péptidos con menos del 50 % de detección, y los valores faltantes de las intensidades de los péptidos recordatorios se rellenaron con k-vecinos más cercanos. Luego, las intensidades de log2 se normalizaron mediante la sustracción de la mediana, ANOVA y cálculos de tasa de descubrimiento falso. Se utilizó un mapa de calor para visualizar la agrupación jerárquica no supervisada de proteínas con un valor de p <0,05 mediante la prueba ANOVA. Para el análisis estadístico de los datos proteómicos marcados con TMT recopilados, seguimos el flujo de trabajo de Foster et al.21, con pocas modificaciones. En primer lugar, se usó el software Partek para calcular los valores p, los valores q, el cambio de pliegue y la relación de cada intensidad peptídica. Los fosfositos con menos del 50 % de valores de densidad faltantes se sometieron a análisis estadístico, y los valores faltantes recordativos se llenaron con los k-vecinos más cercanos. Luego, una normalización de las densidades de Log2 mediante la sustracción de la mediana y determinó el cambio de pliegue, la relación y la significación estadística (valores q y p), de cada uno de los fosfositos seleccionados del conjunto de datos. Los gráficos de volcanes se realizaron con GraphPad Prism 7®. Se utilizó PCA no supervisado en ambos conjuntos de datos por separado con el software Partek®. El conjunto de datos se separó junto con cada componente en relación con la abundancia de pTyr (normalizado, media = 0, varianza = 1).

Se realizó la normalización al proteoma completo mediante la sustracción de intensidad de log2, seguida de una prueba t bilateral y el cálculo moderado de los valores p y q utilizando un algoritmo desarrollado por Herbrich et al.55; Para este análisis se utilizó el software R.

El valor de p hipergeométrico se utilizó para identificar los procesos significativamente enriquecidos en las proteínas y fosfositos que se fosforilan de manera diferencial entre las muestras de casos y controles. Para ello, se utilizó MsigDB23 para analizar las rutas a nivel de proteína y PTMsigDB24 para analizar los procesos a nivel de sitio. La población/antecedentes para los que se calcula el enriquecimiento se restringe a todas las proteínas en las que se cuantifican sus sitios en el experimento de fosfoproteómica, en lugar de a todas las proteínas/fosfositos universalmente conocidos.

La KSEA busca identificar quinasas cuyos objetivos muestren niveles de fosforilación significativamente alterados en una condición dada. KSEA califica cada quinasa k con un conjunto de sustratos S de la siguiente manera:

donde \({\bar{P}}_{S}\) denota el log2 promedio del cambio de pliegue de todos los sustratos de la quinasa k, y \(\bar{P}\) y σ representan el promedio y el estándar desviación de log2 del cambio de pliegue de todos los fosfositos identificados en el conjunto de datos. KSEA se realizó en los módulos identificados restringiendo S a los sustratos en el módulo en lugar de todos los sustratos en el conjunto de datos. Los datos proporcionados por PhosphoSitePLUS30 se utilizaron como referencia para las asociaciones de quinasa-sustrato. Esta herramienta está disponible en el sitio web del Dr. M. Ayati: https://faculty.utrgv.edu/marzieh.ayati/software.html

Primero, se crearon redes en las que los nodos representan proteínas y los bordes representan el PPI obtenido de BioGRID22,56. A las proteínas se les asignó una puntuación en las redes calculando el cambio promedio de veces de los fosfositos que residen en cada proteína obtenida de los experimentos individualmente (es decir, Ntg, TgErbB2 y R403Q-αMyHC Tg). Luego se aplicó MoBaS22 para identificar subredes de proteínas altamente conectadas y fosforiladas diferencialmente. Para la visualización de subredes, las proteínas se colorean en función del cambio de pliegue promedio de esa proteína en diferentes condiciones. Si una proteína en un conjunto de datos no se identifica en otro conjunto de datos, el nodo se representa en color gris.

Se utilizó ANOVA de una vía para comparar las diferencias entre los grupos para analizar los datos de la ecocardiografía. Para el efecto de los tratamientos con AG-825 o vehículo, el tratamiento previo y posterior, utilizamos una prueba t.

Los experimentos se realizaron en réplicas (ver la sección "Métodos"). Se usó Mascot (versión 2.3) para la identificación de péptidos a partir de datos sin procesar de MS y MaxQuant (versión 1.5) para la cuantificación. El análisis estadístico se realizó con R (versión 4.0), Partek Genomics Suit (versión 7.0), GraphPad Prism 7.0 y Perseus (versión 1.5). Los detalles adicionales del procesamiento de datos se describen en la sección "Métodos".

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE57 con el identificador de conjunto de datos PXD036506. Los Datos Suplementarios 1 contienen la fuente numérica de los gráficos presentados en las Figs. 1 y 7. La Fig. 6 complementaria contiene las transferencias de Western sin recortar de la Fig. 1.

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El proyecto descrito fue apoyado por la subvención número K01-HL13368-01 a GARC, 5 T32 HL 7227-43, T32HL125239-05, T32HD044355 de NIH, R01 HL63038, R01 HL114910-01 y AHA 15GRNT25720026 a AMM, R01 HL136 91 a NP, R01 HL088649 a KG y R01LM012980 a MA Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH Agradecemos a la Dra. Leslie Leinwand por facilitar los ratones transgénicos R403Q-αMyHCTg. MX

Estos autores contribuyeron igualmente: Mingguo Xu, Kevin C. Bermea, Marzieh Ayati.

Departamento de Pediatría/División de Cardiología, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Mingguo Xu, Kevin C. Bermea, Amir Heravi, Allen D. Everett, Anne M. Murphy y Genaro A. Ramírez-Correa

Departamento de Pediatría, Tercer Hospital Popular del distrito de Longgang, Shenzhen, 518115, China

Mingguo Xu

Departamento de Ciencias de la Computación/Facultad de Ingeniería y Ciencias de la Computación, Facultad de Medicina del Valle del Río Grande de la Universidad de Texas, Edimburgo, Texas, EE. UU.

marzieh ayati

Departamento de Neurología/Instituto de Ingeniería Celular, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Haga clic en Descargar para guardar Han Byeol Kim - Chan Hyun Na mp3 youtube com

Departamento de Anestesiología, Hospital Qilu, Facultad de Medicina de Cheeloo, Universidad de Shandong, Ji'nan, China

Xiaomei yang

Departamento de Ciencias Moleculares/UT Health Rio Grande Valley, McAllen, TX, EE. UU.

Andres Medina & Genaro A. Ramirez-Correa

Departamento de Pediatría/División de Hematología, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Zongming Fu

Departamento de Cardiología, Hospital Qilu, Facultad de Medicina de Cheeloo, Universidad de Shandong, Ji'nan, China

Xinyu Zhang

Departamento de Química Biológica/Instituto de Medicina Genética McKusick-Nathans, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Chan Hyun Na

Departamento de Patobiología Molecular y Comparada, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

kathleen gabrielson

Departamento de Medicina/División de Cardiología, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

D. Brian Foster y Nazareno Paolocci

Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Padova, Padua, Italia

nazareno paolocci

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MX, AM, HBK, XY, XF, AH, XZ y CHN realizaron experimentos y análisis de datos, AE, KG, DBF y NP brindaron apoyo estadístico y revisión crítica, KCB, MA brindaron apoyo bioinformático y estadístico, MX, KCB, NP, AMM y GARC escribieron el manuscrito, AMM y GARC diseñaron el estudio y supervisaron el trabajo.

Correspondencia a Anne M. Murphy o Genaro A. Ramirez-Correa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Brian Delisle y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Tami Martino y Joao Manuel de Sousa Valente. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Xu, M., Bermea, KC, Ayati, M. et al. La alteración en la fosforilación de tirosina del proteoma cardíaco y la vía EGFR contribuyen a la miocardiopatía hipertrófica. Commun Biol 5, 1251 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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Recibido: 09 noviembre 2020

Aceptado: 22 de septiembre de 2022

Publicado: 15 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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