Año LI

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 600 (2023) Citar este artículo

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La inflamación excesiva es una causa postulada de enfermedad grave y muerte en las infecciones por virus respiratorios. En respuesta a una infección grave por el virus de la influenza, las células T CD4+ específicas de hemaglutinina vírgenes transferidas de forma adoptiva de ratones 6.5 transgénicos con TCR CD4+ impulsan una respuesta Th1 productora de IFN-γ en ratones de tipo salvaje. Ayuda en la eliminación del virus, pero también causa daños colaterales y agravamiento de la enfermedad. Los ratones donantes 6.5 tienen todas las células T CD4+ con especificidad TCR hacia la hemaglutinina de influenza. Aún así, los 6,5 ratones infectados no sufren de una fuerte inflamación y un resultado grave. La respuesta Th1 inicial disminuye con el tiempo, y una respuesta Th17 prominente de emigrantes tímicos recientes alivia la inflamación y otorga protección en 6,5 ratones. Nuestros resultados sugieren que el TGF-β activado por neuraminidasa viral de las células Th1 guía la evolución de Th17, y la señalización de IL-17 a través del receptor EGFR de IL-17 no canónico activa la proteína estructural TRAF4 más que TRAF6 durante el alivio de la inflamación pulmonar en pacientes graves. influenza.

Los virus respiratorios causan enfermedades infecciosas emergentes graves. El resultado clínico depende de la interacción entre el virus invasor y la respuesta inmunitaria del huésped. La invasión viral provoca un efecto citopático que conduce a una lesión tisular en el tracto respiratorio. El sistema inmunitario del huésped reacciona para eliminar el virus, pero la respuesta también contribuye a la inflamación. Si la activación inmunológica y la inflamación disminuyen con la eliminación del virus, el individuo infectado se recupera eficientemente de una infección. Sin embargo, la activación inmune y la inflamación pueden persistir más allá de la eliminación del virus. La activación inmune prolongada y exagerada provoca el agravamiento de la enfermedad. El resultado indeseable de las infecciones por el virus de la influenza estacional o pandémica, el SARS, el MERS y las pandemias de COVID-19 en curso son ejemplos1. La modulación de la inflamación con reacciones inmunitarias abrumadoras es siempre un objetivo en el manejo de la enfermedad. Los corticosteroides como agente comúnmente implementado para sofocar la inflamación pulmonar también afectan la eliminación de patógenos con inflamación suprimida y pueden agravar la enfermedad, como se observa en pacientes con influenza grave2,3,4,5, SARS6, MERS7 y COVID-198.

Apuntar a las citoquinas es otra opción para suprimir la inflamación. Tocilizumab y sarilumab se dirigen a la interleucina (IL)-6 y pueden ayudar a los pacientes con COVID-199. La IL-17 también es una citocina proinflamatoria bien conocida10. Los altos niveles de IL-17 en pacientes con enfermedades graves de COVID-191,11,12, SARS13, MERS14 e influenza15, hacen de la IL-17 un posible blanco de manipulación16. Detectamos IL-17 en el suero de nuestros pacientes con COVID-1911 grave, y también en células T CD4+ específicas del antígeno de la gripe que se infiltran en los pulmones en nuestro modelo experimental de ratón de gripe grave17,18.

En nuestro modelo de ratón específico del antígeno hemaglutinina (HA) de la influenza, el virus de la influenza impulsa una respuesta Th1 de células T CD4+ específicas de HA ingenuas transferidas adoptivamente en los pulmones17,18,19,20,21,22. Las 2,5 × 106 células del donante transferidas adoptivamente ayudan en la eliminación del virus, pero aumentan la inflamación en los pulmones y aumentan la mortalidad. La infección por el virus de la influenza de los ratones donantes, el receptor de células T CD4+ (TCR) transgénico 6.5 ratones23 específicos de HA, impulsa la activación de todas las células T CD4+ en estos ratones, ya que todas sus células T CD4+ tienen los TCR específicos para la HA del virus de la gripe. Esperábamos un resultado grave con una respuesta Th1 tan masiva de todas las células T CD4+ en los 6,5 ratones infectados. Aunque al principio perdieron más peso corporal, sufrieron una leve inflamación pulmonar y se recuperaron bien. Su recuperación se asoció con una respuesta Th17 prominente en los días 6 y 9. Aquí estudiamos el papel de la respuesta Th17 en la protección de ratones contra la influenza grave. Demostramos una evolución guiada Th1 de la respuesta Th17. Nuestros resultados sugieren que el TGF-β activado por neuraminidasa viral de las células Th1 guía la evolución de Th17. La señalización de IL-17 a través del receptor EGFR de IL-17 no canónico activa la proteína estructural TRAF4 más que TRAF6 durante el alivio de la inflamación pulmonar en la influenza grave.

En nuestro modelo de ratón específico para el antígeno de la hemaglutinina (HA) de la influenza17,18,19,20,21,22, los ratones de tipo salvaje recibieron transferencia adoptiva de 2,5 × 106 células T CD4+ 6,5 específicas para HA sin tratamiento previo de 6,5 ratones donantes (ratones WT + 6,5 células) y obtuvo 2,5 × 103 unidades formadoras de placas (ufp) de la cepa PR8 de la infección por el virus de la influenza H1N1. Las células T CD4+ 6.5 específicas de HA que se infiltran en los pulmones (células 6.5 del donante) produjeron IFN-γ con la inducción del factor de transcripción Th1 T-bet (Fig. 1a). Hubo una producción de IL-17 de nivel básico con un factor de transcripción Th17 ROR-γt insignificante (Fig. 1a, Nota complementaria 1, Fig. 1 complementaria). La transferencia adoptiva agravó la enfermedad de los ratones de tipo salvaje con infección por el virus de la influenza. Los pulmones estaban inflamados (Fig. 1b) y las células 6.5 del donante que se infiltraban en los pulmones adquirieron la función efectora el día 6. Estas células aumentaron la proliferación estimulada por el péptido HA de células T CD4+ vírgenes análogas in vitro (Fig. 1b). La carga de virus también disminuyó en el pulmón del día 3 al día 9, como se reveló en el ensayo de placa (Fig. 1c). Los ratones continuaron perdiendo peso corporal hasta el día 8, cuando algunos de ellos comenzaron a morir (Fig. 1c).

Respuesta a–c Th17 y alivio de la inflamación pulmonar en ratones 6.5 transgénicos TCR CD4+ específicos para HA. a Respuestas Th1 y Th17 de células T CD4+ específicas de HA que infiltran los pulmones, b Paneles superiores: patología pulmonar macroscópica el día 6; Paneles inferiores: proliferación de células T CD4+ específicas de HA in vitro con células que responden a la infección de pulmones o bazos (c) carga de virus en los pulmones, pérdida de peso corporal y supervivencia. Los ratones no transgénicos de tipo salvaje (WT) recibieron transferencia adoptiva de 2,5 × 106 células T CD4+ específicas de HA ingenuas con infección, como se describe en el texto, y sirvieron como controles. d Beneficio de supervivencia perdido con deficiencia de IL-17 en ratones 6.5 transgénicos para TCR. Pérdida severa de peso corporal y mortalidad con más secreción de citocinas inflamatorias por parte de las células T CD4+ y CD8+ que infiltran los pulmones en ratones infectados con IL-17KO que en ratones 6.5 transgénicos TCR competentes para IL-17. Las fotografías son representativas, y otros valores son medias ± sd de al menos 3 experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; NS no significativo, p > 0,05; valores de P de dos colas para prueba t no pareada para comparar dos grupos en un momento específico, ANOVA bidireccional para curvas de peso corporal y prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para curvas de supervivencia).

Los ratones donantes de los linfocitos T CD4+ 6.5 específicos de HA ingenuos, los ratones transgénicos TCR 6.5, tienen un TCR monótono en sus linfocitos T CD4+, con el mismo TCR α/β que responde a un epítopo restringido de HA del MHC Clase II I-Ed. del virus de influenza A/PR/8/34 (PR8) cepa H1N123. Esperábamos un resultado grave de la infección por el virus de la influenza en los 6,5 ratones donantes, con una respuesta Th1 masiva de todas las células T CD4+ en los 6,5 ratones infectados. En contraste con nuestra anticipación, la respuesta Th1 prominente con producción de IFN-γ se observó solo en el día 3, pero no después en los días 6 y 9 después de 2.5 × 103 pfu de infección por el virus PR8 (Fig. 1a). En los días 6 y 9, con la activación del factor de transcripción Th17 ROR-γt en el 30 ~ 50 % de las células T CD4+ que infiltran los pulmones, el 25 ~ 40 % de ellas produjeron IL-17 en su lugar (Fig. 1a, Nota complementaria 1, Complementario Figura 2). Los 6,5 ratones infectados mostraron una inflamación pulmonar aliviada (Fig. 1b), y sus células T CD4+ infiltrantes en los pulmones adquirieron una función reguladora el día 6. Estas células suprimieron la proliferación estimulada por el péptido HA de las células T CD4+ vírgenes afines in vitro (Fig. 1b) . Los 6,5 ratones infectados perdieron un peso corporal significativo el día 3. Se recuperaron de la pérdida de peso y todos los ratones sobrevivieron a la infección (Fig. 1c). No había virus vivo en los pulmones el día 9 (Fig. 1c).

IL-17 (interleucina-17A) es una citocina proinflamatoria reconocida que contribuye a la patogenia de muchas enfermedades inflamatorias11,12,13,14,15,16. Pero, una respuesta prominente de IL-17 de las células T CD4+ que infiltran los pulmones está asociada con una inflamación pulmonar aliviada aquí en los 6,5 ratones infectados. El alivio de la inflamación pulmonar y la protección frente a la infección por el virus de la gripe se perdieron en los ratones 6,5 knockout (KO) para IL-17. Con 2,5 × 103 ufp de virus de la influenza PR8, los ratones IL-17KO 6,5 sufrieron una enfermedad grave. Las células T IL-17KO CD4+ y CD8+ que infiltran los pulmones produjeron más citoquinas inflamatorias IFN-γ y TNF-α el día 6 (Fig. 1d).

Las células T CD4+ activadas se expanden al principio, seguidas por la contracción del conjunto de células. La activación impulsada por el virus de la influenza de las células T 6.5 CD4+ específicas de HA ingenuas transferidas adoptivamente también siguió una tendencia similar en ratones de tipo salvaje infectados (ratones WT + 6.5 células) durante nuestros experimentos. El grupo de células donantes 6.5 se expandió inicialmente y luego se contrajo en los pulmones de ratones de tipo salvaje (Fig. 2a). Por el contrario, la población de células T CD4+ que infiltran los pulmones disminuyó en los 6,5 ratones infectados en los primeros 4 días. Luego comenzó a aumentar y volver al nivel anterior a la infección el día 11 posterior a la infección (Fig. 2a). Las células del timo de 6,5 ratones, los nuevos emigrantes tímicos, pueden reponer la población de células T CD4+ que infiltran los pulmones. Por lo tanto, probamos el perfil de expresión de CD24 y Qa2 de las células T CD4+ que infiltran los pulmones en 6,5 ratones infectados. Se sabe que los timocitos maduros expresan un alto nivel de CD24 y un mínimo de Qa2. Las células T CD4+ o CD8+ pierden CD24 y ganan expresiones de Qa2 con el tiempo después de ser liberadas a la periferia24. Entre las células T CD4+ que infiltran los pulmones de los 6,5 ratones infectados, encontramos una mayor expresión de CD24 y menor de Qa2 en la superficie de las células productoras de IL-17 que en las células productoras de IFN-γ en el día 6 (Fig. 2a).

a Emigrantes tímicos recientes secretan más IL-17 y menos IFN-γ en los pulmones infectados de 6,5 ratones: Panel izquierdo: cinética de la población de células T CD4+ específicas de HA que infiltran los pulmones en 6,5 ratones infectados. Los ratones WT con células transferidas adoptivamente sirvieron como controles, como se describe en el texto. Paneles central y derecho: perfiles de expresión de CD24 y Qa2 de linfocitos T CD4+ que infiltran los pulmones que producen IL-17 o IFN-γ en 6,5 ratones infectados. b–d La timectomía suprime el suministro de emigrantes tímicos recientes y 6.5 ratones timectomizados sufren una enfermedad grave con menos producción de IL-17: b Producción de IL-17 e IFN-γ con ROR-γt y T-bet inducción de HA-infiltrante pulmonar Células T CD4+ específicas y c Carga de virus en los pulmones el día 7. d Pérdida de peso corporal después de la infección. 6,5 ratones no timectomizados sirvieron como controles. Los ratones WT con células transferidas adoptivamente sirvieron como otro grupo de ratones de control, como se describe en el texto. Los histogramas y los diagramas de puntos son representativos, y otros valores son medias ± sd de al menos 3 experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; valores de P de dos colas para la prueba t no pareada para comparar dos grupos en un punto de tiempo específico, ANOVA de dos vías para curvas de peso corporal).

Para validar el hallazgo anterior que sugiere que los emigrantes tímicos recientes son la fuente de IL-17 en los pulmones de 6,5 ratones infectados, realizamos timectomía en 6,5 ratones de 2 semanas de edad e infectamos a los 6,5 ratones timectomizados después de 2 semanas de recuperación de la enfermedad. cirugía. La timectomía es la extirpación quirúrgica de la glándula del timo. Suprime así la oferta de emigrantes tímicos. Después de 2,5 × 103 pfu de infección por el virus de la influenza PR8, 6,5 ratones timectomizados tuvieron menos inducción de ROR-γt y producción de IL-17 en las células T CD4+ que infiltran los pulmones el día 7 (Fig. 2b). Las proporciones de células productoras de IFN-γ no cambiaron con la timectomía, y aproximadamente el 15 % de las células T CD4+ infiltrantes en los pulmones produjeron IFN-γ en los 6,5 ratones timectomizados y no timectomizados en ese momento (Fig. 2b). Como resultado, la timectomía eliminó la dominancia de IL-17 en ratones 6.5 infectados y revirtió la distribución entre IL-17 e IFN-γ al patrón similar al de las células 6.5 del donante en ratones de tipo salvaje infectados (Fig. 2b). Con esta respuesta Th alterada, la timectomía provocó una mayor carga de virus en los pulmones (Fig. 2c) y agravó la enfermedad con una mayor pérdida de peso corporal (Fig. 2d) en los 6,5 ratones infectados. Estos resultados corroboran nuestros hallazgos que sugieren que Th17 es una respuesta protectora de emigrantes tímicos recientes en 6,5 ratones infectados.

La involución tímica provoca una disminución del suministro de emigrantes tímicos con la edad. Similar a los ratones de tipo salvaje, había alrededor de 50 millones de timocitos en 6,5 ratones de 4 semanas de edad. El número disminuyó a 40 millones en 8 semanas de edad y 20 millones en 6,5 ratones de 12 semanas de edad. Solo había 10 millones de timocitos en 6,5 ratones de 40 semanas de edad (Fig. 3a). Además, había menos células CD4+CD8+ doblemente positivas en los timocitos CD3+ con la edad (Fig. 3b). La infección por el virus de la influenza indujo una menor respuesta Th17 en ratones de 6,5 años de edad en comparación con ratones jóvenes de 6,5 años. Alrededor del 30 % de las células T CD4+ que infiltran los pulmones produjeron IL-17 en 6,5 ratones de 4 u 8 semanas de edad el día 7 después de la infección con 2,5 × 103 pfu del virus de la influenza PR8. El número disminuyó a menos del 20% en 12 semanas de edad y alrededor del 10% en 6.5 ratones de 40 semanas de edad (Fig. 3c, d). Sin embargo, el porcentaje de células productoras de IFN-γ no cambió con la edad, y alrededor del 10 al 12 % de las células T CD4+ que infiltran los pulmones produjeron IFN-γ en los 6,5 ratones de 4 a 40 semanas de edad (Fig. 3c, d) . Como el porcentaje de células productoras de IFN-γ no cambió con la edad, la dominancia de IL-17 sobre la producción de IFN-γ también disminuyó con la edad (Fig. 3e). La carga de virus en los pulmones fue mayor en los ratones 6.5 viejos que en los jóvenes el día 7 después de la infección (Fig. 3f). Los ratones 6.5 viejos padecían una enfermedad más grave que los ratones 6.5 jóvenes, con una recuperación retrasada de la pérdida de peso (Fig. 3g).

a Números de timocitos y b porcentaje de células CD4+CD8+ en timocitos CD3+ en 6,5 ratones sanos no infectados de las edades indicadas. Los diagramas de puntos c y los gráficos de barras d muestran respuestas de IL-17 menguante y mantenidas de IFN-γ de células T CD4+ específicas de HA que se infiltran en los pulmones con una edad de 6,5 ratones el día 7 después de la infección. e Perdió el dominio de la respuesta de IL-17 sobre la respuesta de IFN-γ de células T CD4+ específicas de HA que infiltran los pulmones con una edad de 6,5 ratones el día 7 después de la infección. f Mayor carga de virus en los pulmones el día 7 después de la infección, y g retraso en la recuperación de la pérdida de peso corporal con la edad en 6,5 ratones infectados. Los diagramas de puntos son representativos y otros valores son medias ± sd de al menos 3 experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; *p < 0,01; NS no significativo, p > 0,05; P de dos colas valores para la prueba t no pareada para comparar dos grupos en un punto de tiempo específico, ANOVA de dos vías para curvas de peso corporal).

Ideamos un experimento con dos transferencias adoptivas de células T CD4+ 6.5 específicas de HA ingenuas en ratones de tipo salvaje infectados (ratones WT + 2 lotes de 6.5 células) para imitar emigrantes tímicos secuenciales en 6.5 ratones (Fig. 4a). Las células del donante 6.5 transferidas con infección se diferenciaron en células Th1 productoras de IFN-γ, y las células del donante 6.5 transferidas 4 días después se diferenciaron en células Th17 productoras de IL-17 el día 8 después de la infección en los pulmones de ratones de tipo salvaje (Fig. 4a–c, Nota complementaria 2, Figura complementaria 3). En presencia de células Th1 derivadas de la primera transferencia, el 30 % de las células de la segunda transferencia produjeron IL-17 y sólo menos del 2 % produjeron IFN-γ. Alrededor del 5% de las células productoras de IL-17 también produjeron IFN-γ (Fig. 4d). Las segundas células de transferencia también modificaron el fenotipo de las primeras células de transferencia. Hubo una reducción del 40% en la producción de IFN-γ el día 8 después de la infección (Fig. 4d). En controles de transferencia única (ratones WT + células 6.5 de un solo lote), las células 6.5 del donante transferidas con infección o en los días 4 después de la infección eran células Th1 productoras de IFN-γ prominentes el día 8 después de la infección en los pulmones de ratones de tipo salvaje . Solo hubo una disminución marginal de la producción de IFN-γ y un aumento marginal de la producción de IL-17 de las células transferidas el día 4 en comparación con las células transferidas con infección. (Figura 4).

a Paneles izquierdos: Diagrama esquemático del experimento de transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de HA ingenuas de dos lotes en ratones de tipo salvaje infectados, como se describe en el texto. Paneles de la derecha: respuesta Th17 de las células del segundo lote en presencia de las células del primer lote en los pulmones de ratones de tipo salvaje infectados con transferencia de células en dos lotes. b Producción de IL-17 y c IFN-γ del primer y segundo lote de células el día 8 en los pulmones de ratones de tipo salvaje infectados con una transferencia de células T CD4+ específicas de HA de un solo lote o dos lotes. d Coproducción de IFN-γ por los linfocitos T CD4+ específicos de HA del segundo lote que producen IL-17 el día 8 en presencia o ausencia de linfocitos T CD4+ específicos de HA del primer lote transferidos adoptivamente. e Coproducción de IFN-γ por el primer lote de células T CD4+ específicas de HA productoras de IL-17 en presencia o ausencia de las células del segundo lote en este momento. Los diagramas de puntos son representativos y otros valores son medias ± DE de al menos tres experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; *p < 0,01; NS no significativo, p > 0,05; P de dos colas valores para la prueba t no pareada).

En el experimento de ratones de tipo salvaje con dos transferencias adoptivas de células T CD4+ 6.5 específicas de HA ingenuas (ratones WT + 2 lotes de células 6.5), la respuesta Th17 productora de IL-17 de las células 6.5 del segundo donante de transferencia se asoció con una dominancia disminuida de T-bet sobre ROR-γt (Fig. 5a, b). Hubo una transducción de señales de TCR comparable desde la fosforilación de ZAP-70 hasta la inducción del factor de transcripción Th1 característico T-bet en las células donantes 6.5 de ambas transferencias (Fig. 5c). Con la inducción sustancial de T-bet, hubo una fuerte activación del factor de transcripción ROR-γt asociado a Th17 en las células 6.5 del donante de la segunda transferencia (Fig. 5d). Las células donantes 6.5 de la segunda transferencia produjeron IL-17 en lugar de IFN-γ con el dominio reducido de T-bet sobre ROR-γt (Fig. 5b-d). Además, hubo una mayor expresión del marcador de células T reguladoras inducidas (iTreg) LAG-3 en las células donantes 6.5 de la segunda transferencia (Fig. 5e).

a Diagrama esquemático y respuesta Th17 con b dominancia reducida de T-bet sobre ROR-γt de las células donantes del segundo lote en el experimento de transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de HA ingenuas de dos lotes en ratones de tipo salvaje infectados. c Fuerza comparable de la señalización de TCR desde la fosforilación de ZAP70- hasta la inducción de T-bet en el primer lote de células Th1 y el segundo lote de células Th17 en los pulmones el día 8 después de la infección. Los números representan MFI (intensidad de fluorescencia media) de las moléculas indicadas. d Tamaño de población de Foxp-3+ inalterado con mayor activación de ROR-γt del segundo lote en comparación con las células del donante del primer lote en el día 8. e Mayor expresión del marcador iTreg LAG-3 en la superficie del segundo lote en comparación con las células del donante del primer lote en este momento. f Facilitó la recuperación de la pérdida de peso corporal y mejoró la supervivencia de los ratones de tipo salvaje infectados con dos lotes de transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de HA ingenuas que los ratones con una transferencia de células afines de un solo lote. g Patología pulmonar macroscópica y puntajes patológicos de secciones de pulmón, y h Carga de virus en los pulmones de ratones de tipo salvaje infectados con dos lotes de transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de HA ingenuas que los ratones con una transferencia de células afines de un solo lote. Las fotografías, histogramas y diagramas de puntos son representativos, y otros valores son medias ± sd de al menos tres experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0.0001; **p < 0.001; *p < 0.01; NS non- significativo, p > 0,05; valores de P de dos colas para la prueba t no pareada para comparar dos grupos en un punto de tiempo específico, ANOVA de dos vías para las curvas de peso corporal y la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para las curvas de supervivencia).

Las dos transferencias adoptivas de células 6.5 del donante ayudaron a los ratones de tipo salvaje receptores a recuperarse de la infección de manera más eficiente con una mejor supervivencia, en comparación con los ratones con una transferencia de células 6.5 del donante solamente (Fig. 5f). Hubo una protección mejorada con menos patología (Fig. 5g) y una carga viral más baja en los pulmones el día 8 después de la infección (Fig. 5h).

Definimos aún más el papel protector de la IL-17 del segundo lote de células en el experimento con dos transferencias adoptivas, mediante el uso de células donantes 6.5 de ratones IL-17KO 6.5 sin tratamiento previo en la segunda transferencia adoptiva ((ratones WT + 1.er lote 6.5 células + Segundo lote de células IL-17KO 6.5 (Fig. 6a). El reemplazo de las células de la segunda transferencia con células IL-17KO del donante 6.5 eliminó la protección con dos transferencias de células IL-17 del donante competente 6.5 (Fig. 6b). A pesar de la eliminación facilitada del virus con las células IL-17KO 6.5 del donante (Fig. 6c), los ratones padecían enfermedad agravada con mayor mortalidad con menos IL-17 (Fig. 6d, f) y más producción de IFN-γ inflamatorio en las células 6.5 del donante de ambas transferencias ( Figura 6e, f).

a Diagrama esquemático yb protección perdida del experimento de transferencia adoptiva de dos lotes en ratones de tipo salvaje infectados con la transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de IL-17KO HA ingenuas en el segundo lote. c Carga de virus del día 8 en los pulmones de ratones de tipo salvaje infectados en un experimento de transferencia de células T CD4+ específicas de HA ingenuo de dos lotes, con células de segundo lote competentes IL-17KO o IL-17. d Producción inalterada de IL-17 por las células del primer lote, y e impulsó la producción de IFN-γ por las células del primer y segundo lote con la transferencia de células T CD4+ específicas de HA IL-17KO sin tratamiento previo del segundo lote. f Diagramas de puntos representativos de la producción de IL-17 e IFN-γ por células del primer y segundo lote con la transferencia de células T CD4+ específicas de IL-17 o HA específicas de IL-17KO del segundo lote. Los valores son medias ± sd de al menos tres experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; *p < 0,01; NS no significativo, p > 0,05; valores de P de dos colas para prueba t no pareada para comparar dos grupos en un momento específico y la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para las curvas de supervivencia).

La neuraminidasa del virus de la influenza PR8 activa el TGF-β de las células T CD4+ específicas de HA18, y el TGF-β es una citoquina indispensable para la polarización Th17 in vitro25. Los linfocitos T CD4+ 6,5 específicos de HA ingenuos se transfirieron de forma adoptiva a ratones de tipo salvaje (ratones WT + 6,5 células) y los ratones se infectaron con 2,5 × 103 pfu del virus PR8. Las células 6.5 del donante que se infiltraron en los pulmones habían activado el TGF-β el día 4 después de la infección en ratones de tipo salvaje (Fig. 7a). Se recuperaron de los ratones receptores en ese momento para cocultivar in vitro con linfocitos T CD4+ 6,5 vírgenes. Sin cocultivo, las células T 6.5 CD4+ vírgenes eran células Th1 y el 16 % de ellas produjeron IFN-γ después de 48 h de estimulación con el virus PR8 in vitro. Cuando se cocultivaron con las células 6.5 del donante que se infiltraron en los pulmones el día 4, las células T CD4+ 6.5 vírgenes estaban sesgadas hacia las células Th17. Alrededor del 20% de ellos produjeron IL-17 y solo el 7% de ellos produjeron IFN-γ (Fig. 7b). El anticuerpo anti-TGF-β aumentado con TGF-β de ratón recombinante atenuó la producción de IL-17 de las células T CD4+ 6,5 (Fig. 7c). El virus vaccinia portador de HA (Vac-HA) activado transfirió de forma adoptiva 6,5 células T CD4+ ingenuas específicas de HA in vivo a una amplitud comparable a la del virus de la influenza PR8. Como Vac-HA no tiene neuraminidasa, las células del donante 6.5 no recibieron TGF-β activado. Después de la recuperación de los ratones receptores el día 4, estas células 6.5 de donante infiltrantes de pulmón activadas con Vac-HA no sesgaron las células Th1 en células Th17 en el cultivo in vitro (Fig. 7).

una activación de TGF-β en las células T CD4+ específicas de HA por el virus de la influenza, pero no por el virus vaccinia insertado en HA (Vac-HA). Panel superior: los esplenocitos de ratones 6.5 transgénicos para TCR específicos para HA se estimularon durante la noche con virus de la influenza o Vac-HA. Panel inferior: Los ratones de tipo salvaje recibieron transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de HA ingenuas con infección por influenza o virus Vac-HA, y las células pulmonares se analizaron el día 4. b Las células pulmonares del día 4 se mezclaron con esplenocitos ingenuos de células Ratones TCR-transgénicos 6.5 y estimulados con virus influenza durante 48 h in vitro. c La adición de TGF-β de ratón recombinante potenciado y anticuerpo anti-TGF-β de ratón atenuó la producción de IL-17 por parte de las células T CD4+ específicas de HA en el cocultivo. Los histogramas y los diagramas de puntos son representativos.

En nuestro informe anterior, demostramos la activación aumentada de TGF-β de las células T CD4+ específicas de HA en ausencia de IL-1018. Aquí, probamos dos transferencias de células IL-10KO de donante 6.5 a ratones IL-10KO (ratones IL-10KO + 2 lotes de células IL-10KO 6.5; conjunto IL-10KO), la primera transferencia con infección por el virus de la influenza PR8 y la segunda transferencia en 4 días después de la infección. Dos transferencias de células 6.5 de donantes competentes para IL-10 en ratones de tipo salvaje (ratones WT + 2 lotes de 6.5 células; conjunto WT) sirvieron como controles (Fig. 8a, Nota complementaria 3, Figura complementaria 4). Hubo una mayor cantidad de TGF-β activo en las células 6.5 del donante IL-10KO de la primera transferencia en el entorno IL-10KO sin IL-10, en comparación con las células 6.5 del donante competente en IL-10 de la primera transferencia en el entorno WT con IL-10 (Fig. 8b). Además, hubo una mayor cantidad de IL-17 en las 6,5 células del donante IL-10KO de la segunda transferencia en el entorno IL-10KO sin IL-10, en comparación con las 6,5 células del donante competente en IL-10 de la segunda transferencia en el entorno WT con IL-10. Alrededor del 60 % de las células de la segunda transferencia produjeron IL-17 en ausencia de IL-10 el día 8 después de la infección, en comparación con el 25 % en el entorno con IL-10 (Fig. 8c), y la producción de IL-17 del las segundas células de transferencia se vincularon con la protección contra la infección por el virus de la influenza en ratones IL-10KO (Nota complementaria 3, Figura complementaria 4).

a–c Experimento de transferencia adoptiva de dos lotes en ausencia de IL-10. a Diagrama esquemático: células T CD4+ específicas de HA IL-10KO ingenuas se transfirieron adoptivamente a ratones IL-10KO los días 0 y 4 después de la infección (conjunto IL-10KO). Los ratones WT infectados con células T CD4+ específicas de HA competentes para IL-10 (conjunto WT) sirvieron como control. b Más TGF-β del primer lote de células donantes IL-10KO y c respuesta Th17 intensificada del segundo lote de células donantes IL-10KO en el conjunto IL-10KO el día 8. d, e Experimento de transferencia adoptiva de dos lotes en animales silvestres ratones de tipo con infección por el virus vaccinia insertado en HA (Vac-HA). d Sin respuesta Th17 de las células del donante del segundo lote en ratones con infección por Vac-HA. Los histogramas y los diagramas de puntos son representativos, y otros valores son medias ± sd de al menos tres experimentos (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; valores de P de dos colas para la prueba t no pareada).

A continuación, realizamos un experimento similar de dos transferencias en el entorno WT (ratones WT + 2 lotes de 6,5 células) con virus vaccinia insertado con HA (Vac-HA) en lugar de infección por el virus de la influenza PR8 (Fig. 8d). Las células del donante 6.5 de ambas transferencias, transferidas con infección y transferidas el día 4, fueron activadas en el fenotipo Th1 por la infección con Vac-HA, como se esperaba con la ausencia de TGF-β activo en las células del donante 6.5 de la primera transferencia (Fig. 8e).

La señalización de IL-17 a través de su conocido receptor IL-17RA contribuye a la inflamación26. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; ErbB-1; HER1) se ha descrito como un receptor no canónico para IL-17. Se ha demostrado que la señalización de IL-17 con EGFR participa en el proceso de cicatrización de heridas27. Infectamos 6,5 ratones con 2,5 × 103 ufp de la cepa PR8 del virus de la gripe. Los ratones de tipo salvaje recibieron transferencia adoptiva de células de donante 6.5 vírgenes con la infección (ratones WT + 6.5 células; conjunto WT), y los ratones IL-17KO recibieron transferencia adoptiva de células de donante 6.5 IL-17KO vírgenes con la infección (ratones IL-17KO + IL-17KO 6.5 celdas; conjunto IL-17KO). Hubo una regulación al alza tanto de IL-17RA como de EGFR en las células T CD4+ que infiltran los pulmones en 6,5 ratones después de la infección por el virus de la influenza. IL-17RA se reguló al alza solo el día 3 después de la infección, pero no después. El EGFR se reguló gradualmente desde el día 3 hasta el día 6 y el día 9 después de la infección (Fig. 9a). EGFR fue más abundante que IL-17RA en la superficie celular desde el día 6 hasta el día 9 después de la infección (Fig. 9b). La regulación positiva de IL-17RA y EGFR también estuvo presente en las células 6.5 e IL-17KO 6.5 del donante infiltrado en los pulmones del conjunto WT y el conjunto IL-17KO, respectivamente (Fig. 9a, b, Nota complementaria 4, Figura complementaria 5) . Sin embargo, hubo un predominio de EGFR sobre IL-17RA en las superficies de células T CD4+ que infiltran los pulmones el día 6 pero no el día 9 en el grupo WT. No hubo dominancia de EGFR sobre IL-17RA en los días 6 y 9 en el conjunto IL-17KO (Fig. 9b).

a Expresiones de EGFR e IL-17RA en la superficie de células T CD4+ que infiltran los pulmones en ratones 6.5 transgénicos para TCR infectados, ratones de tipo salvaje y ratones IL-17KO. Los ratones sanos no infectados (ingenuos) sirvieron como controles. Los gráficos de barras muestran la regulación hacia arriba o hacia abajo de las expresiones de EGFR e IL-17RA con el tiempo después de la infección en estos ratones. b Abundancia de EGFR que IL-17RA en la superficie de las células T CD4+ que se infiltran en los pulmones los días 6 y 9 después de la infección en 6,5 ratones. c Mayor fosforilación de EGFR de las células T CD4+ que infiltran los pulmones en los 6,5 ratones infectados los días 6 y 9. d–e Fosforilación de EGFR en las 6,5 células T CD4+ después de 48 h de estimulación con 0,03 MOI del virus PR8 in vitro. Se estimularon esplenocitos de ratones vírgenes competentes para IL-17 e IL-17KO 6.5, y los esplenocitos de ratones de tipo salvaje sirvieron como controles. Se añadió IL-17 recombinante de ratón (0,1 o 1,0 μg/ml) o Gefitinib (1,0 μM) a las condiciones de cultivo, como se indica en el texto. f Dominio de TRAF4 sobre TRAF6 en los pulmones de 6.5 ratones infectados, en contraste con el dominio de TRAF6 sobre TRAF4 en los pulmones de ratones infectados de tipo salvaje e IL-17KO según lo determinado por los niveles de ARNm en células T CD4+ que infiltran los pulmones y descrito en el texto. g Tinción intracelular de TRAF4 en las células T CD4+ 6,5 después de 48 h de estimulación con virus PR8 0,03 MOI in vitro. Se estimularon esplenocitos de ratones vírgenes competentes para IL-17 e IL-17KO 6.5, y los esplenocitos de ratones de tipo salvaje sirvieron como controles. Se añadió IL-17 recombinante de ratón (0,1 o 1,0 μg/ml) o Gefitinib (1,0 μM) a las condiciones de cultivo, como se indica en el texto. h Colocalización de EGFR y TRAF4 en 6.5, IL-17KO 6.5 y células T CD4+ de tipo salvaje después de 48 h de estimulación con virus PR8 de 0,03 MOI in vitro. Los histogramas y fotografías son representativos, y otros valores son medias ± sd de al menos tres experimentos. (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; NS no significativo, p > 0,05; valores de P de dos colas para la prueba t no pareada).

Los 6,5 ratones infectados tenían una gran cantidad de EGFR en la superficie de las células T CD4+ que infiltran los pulmones, y se asoció con una mayor fosforilación de EGFR el día 9 que el día 6 y el día 3. Por el contrario, solo se detectó un nivel básico de EGFR fosforilado. en las células 6.5 del donante que se infiltraron en el pulmón del conjunto WT y las células IL-17KO del conjunto IL-17KO del donante en los días 3, 6 y 9 (Fig. 9c). Tras la estimulación de los esplenocitos de ratones 6,5 vírgenes, ratones IL-17KO 6,5 o ratones WT con 0,03 MOI del virus de la influenza durante 48 h in vitro, hubo más fosforilación de EGFR de 6,5 células T CD4+ que de células T IL-17KO 6,5 CD4+ ( Figura 9d). El suplemento de IL-17 aumentó la fosforilación de EGFR de las células T CD4+ IL-17KO 6.5 de una manera dependiente de la dosis, más aumento con 1.0 que 0.1 μg/ml de IL-17 de ratón recombinante (Fig. 9e). El inhibidor de EGFR Gefitinib mitigó la fosforilación de EGFR de 6,5 células T CD4+ y la fosforilación de EGFR inducida por IL-17 de IL-17KO 6,5 células T CD4+ (Fig. 9e). Las células T CD4+ de tipo salvaje de ratones WT ingenuos sirvieron como controles, en los que el suplemento de IL-17 aumentó y Gefitinib atenuó la fosforilación de EGFR (Fig. 9e).

La familia de factores asociados al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF) (TRAF 1 a 7) de siete proteínas de andamiaje está involucrada en varios procesos fisiológicos celulares28. Los TRAF, como moléculas adaptadoras, moderan muchas vías de señalización. TRAF4 y TRAF6 comparten los mismos sitios de unión de TRAF, pero juegan diferentes roles en la patogénesis29,30. Un estudio de PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real de las células pulmonares del día 6 reveló una regulación positiva de TRAF4 y TRAF6 en los 6,5 ratones infectados. El TRAF4 era dominante sobre el TRAF6 en las células T CD4+ que infiltran los pulmones de 6,5 ratones infectados (Fig. 9f). En contraste, TRAF6 fue dominante sobre TRAF4 en el donante infiltrante de pulmón 6.5 células T CD4+ de tipo salvaje infectado (ratones WT + 6.5 células; conjunto WT) o donante IL-17KO 6.5 células T CD4+ de ratones infectados IL-17KO (IL -ratones 17KO + células IL-17KO 6,5, conjunto IL-17KO, Fig. 9f). Tras una estimulación in vitro similar, como se describe anteriormente, la citometría de flujo reveló una mayor regulación de la proteína TRAF4 en 6.5 que en las células T CD4+ IL-17KO 6.5 (Fig. 9g). El suplemento de IL-17 aumentó la regulación ascendente de TRAF4 en células T CD4+ IL-17KO 6.5 de una manera dependiente de la dosis, más aumento con 1.0 que 0.1 μg/ml de IL-17 de ratón recombinante (Fig. 9g). El inhibidor de EGFR Gefitinib mitigó la regulación positiva de TRAF4 en células T CD4+ 6.5 y la regulación positiva de TRAF4 inducida por IL-17 en células T CD4+ IL-17KO 6.5 (Fig. 9g). Las células T CD4+ de tipo salvaje de ratones WT ingenuos sirvieron como controles, en los que el suplemento de IL-17 aumentó y Gefitinib atenuó la regulación positiva de TRAF4 (Fig. 9g).

La microscopía confocal reveló la translocación de TRAF4 al complejo de señalización de EGFR en las células T CD4+ 6.5, tras la estimulación de esplenocitos de ratones 6.5 ingenuos con virus de influenza MOI 0.03 durante 48 h in vitro (Fig. 9h). La colocalización de TRAF4 y EGFR fue más significativa en las células T 6.5 CD4+ que en las células T IL-17KO 6.5 CD4+. El suplemento de IL-17 aumentó la colocalización de TRAF4 y EGFR en las células T CD4+ IL-17KO 6.5 estimuladas (Fig. 9h). El inhibidor de EGFR Gefitinib mitigó la colocalización de TRAF4 y EGFR en células T CD4+ 6.5 y la colocalización de TRAF4 y EGFR inducida por IL-17 en células T CD4+ IL-17KO 6.5 (Fig. 9h).

Gefitinib es un inhibidor de EGFR, que interrumpe la señalización a través del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en las células diana. Gefitinib agravó la enfermedad de la infección por el virus de la influenza en ratones. El impacto de la inhibición de EGFR con Gefitinib fue más alto en ratones 6.5 infectados, moderado en ratones de tipo salvaje infectados e insignificante en ratones IL-17KO infectados (Fig. 10a). En los ratones de tipo salvaje infectados, el suplemento de IL-17 intranasal otorgó cierta protección, y la protección se perdió con el tratamiento con Gefitinib (Fig. 10b). El beneficio perdido se asoció con una regulación positiva alterada de TRAF4 y TRAF6 en los pulmones. El suplemento de IL-17 alteró la dominancia de TRAF6 sobre TRAF4 en los pulmones de ratones de tipo salvaje infectados, y la alteración se restringió cuando se administró el suplemento de IL-17 con tratamiento con Gefitinib (Fig. 10b).

una inhibición de EGFR con Gefitinib dio como resultado una mayor pérdida de peso corporal y una mayor mortalidad de 6,5 ratones infectados con el virus de la influenza. Los ratones de tipo salvaje e IL-17KO infectados sirvieron como controles. b El tratamiento con gefitinib también disminuyó la protección conferida por el suplemento de IL-17 y resultó en una mayor pérdida de peso corporal y una mayor mortalidad de los ratones de tipo salvaje infectados. Las alteraciones se asociaron con una dominancia alterada de TRAF4 sobre los niveles de ARNm de TRAF6. Los valores son medias ± sd de al menos tres experimentos. (n = 6/grupo; ***p < 0,0001; NS no significativo, p > 0,05; valores de P de dos colas para la prueba t no pareada para comparar dos grupos en un punto de tiempo específico, ANOVA de dos vías para el peso corporal curvas de supervivencia y prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para curvas de supervivencia).

Aquí demostramos que el TGF-β activado por el virus de la influenza de las células Th1 guía la evolución Th17 de los emigrantes tímicos recientes. La señalización de IL-17 a través del receptor EGFR de IL-17 no canónico activa la proteína estructural TRAF4 más que TRAF6 durante el alivio de la inflamación pulmonar en la influenza grave. Las células T CD4+ 6.5 específicas de HA transferidas adoptivamente causaron daño colateral con su respuesta Th1 productora de IFN-γ a la infección en ratones de tipo salvaje. Los ratones donantes de linfocitos T CD4+ 6.5 específicos de HA ingenuos, los ratones transgénicos TCR 6.5, tienen todos los linfocitos T CD4+ sensibles al antígeno HA del virus de la gripe. La abrumadora respuesta de las células T CD4+ en los 6,5 ratones infectados causaría más daño y una enfermedad más grave. La enfermedad se agravó al principio, pero la evolución posterior de una respuesta Th17 prominente mitigó la enfermedad y los 6,5 ratones tuvieron una mejor supervivencia que los ratones de tipo salvaje. Tanto los linfocitos T CD4+ Th1 como los Th17 se activaron para el compromiso de Th1 con señalización de TCR comparable desde la fosforilación de ZAP-70 hasta la inducción de T-bet. La evolución de Th17 se asoció con la regulación positiva de ROR-γt y una dominancia reducida de T-bet sobre ROR-γt. La timectomía, los experimentos con ratones envejecidos y los experimentos de transferencia adoptiva repetitiva revelaron que las células Th1 CD4+ T guiaron la evolución Th17, asociadas con el TGF-β activado por neuraminidasa viral en las células Th1. La señalización de IL-17 a través del EGFR ocurrió con abundancia relativa de EGFR a IL-17RA en 6,5 ratones transgénicos TCR CD4+. La señalización activa la proteína de armazón TRAF4 más que TRAF6. El bloqueo de gefitinib documentó la importancia de la señalización de IL-17 a través de EGFR en el alivio de la inflamación pulmonar en la influenza grave.

Tanto el IFNγ como la IL-17 son constituyentes fundamentales de la tormenta de citocinas en la gripe grave con neumonía31. El IFN-γ es una citocina Th1 característica esencial para la eliminación viral32. En nuestro sistema experimental, las células T CD4+ específicas de HA que se infiltran en los pulmones producen IFN-γ en respuesta a la infección17,18. El factor de transcripción T-bet dirige el compromiso con el linaje Th1 y la producción de IFN-γ33,34. Aquí encontramos que nuestra evolución de Th17 también fue precedida por el compromiso de Th1 con una fuerza comparable de señalización de TCR desde la fosforilación de ZAP-70 hasta la inducción de T-bet. TGF-β es indispensable para la polarización Th17 de células T CD4+ vírgenes in vitro25. Revelamos que el TGF-β viral activado por neuraminidasa de las células T Th1 CD4+ es esencial para la evolución guiada por Th1 de las células Th17. Los linfocitos T Th1 CD4+ dirigieron la activación del factor de transcripción ROR-γt específico de Th17 y la producción de la citoquina IL-17 específica de Th17.

Se ha demostrado que el factor de transcripción Th1 T-bet suprime la diferenciación Th2 y Th1735,36. Sin embargo, se ha detectado coproducción de IFN-γ e IL-17 en células T CD4+ humanas25,37 y se ha documentado coproducción de IFN-γ e IL-10 en células T CD4+ murinas18. Los niveles de expresión relativos de los factores de transcripción T-bet, GATA-3 y ROR-γt pueden ajustar el equilibrio entre diferentes linajes del paradigma Th1/Th2/Th17 convencional. Una dominancia disminuida de T-bet sobre GATA-3 y ROR-γt elimina la producción de IFN-γ de células T CD4+ específicas de HA que infiltran los pulmones en nuestro sistema experimental17. Aquí, en el mismo sistema experimental de influenza grave, demostramos la diferenciación de Th17 con una dominancia disminuida de T-bet sobre ROR-γt. Esta activación excesiva de ROR-γt condujo a las células T CD4+ comprometidas Th1 al linaje Th17 y abolió la producción de IFN-γ.

El papel de la IL-17 seguía siendo incierto. La IL-17 está ligada a la inflamación localizada y patógena en ciertas enfermedades autoinmunes, en las que la IL-17 se une a su receptor canónico IL-17RA y activa TRAF6 y la cascada de señalización posterior26,28,38. La IL-17 es antiinflamatoria en otras enfermedades39,40,41. La IL-17 es muy versátil y se ha implicado en otras condiciones no patógenas, incluida la reparación de tejidos y el cáncer42, en las que la IL-17 se une al EGFR reclutado en el complejo del receptor y activa TRAF4 y la cascada de señalización posterior27,39. La activación de TRAF4 puede restringir los procesos patogénicos mediados por IL-1730. Nuestras células Th17 específicas de HA eran similares a las células Th17 no patógenas25, ya que no producen IFN-γ y no aumentan la inflamación. También hubo señalización a través de EGFR y posterior activación de TRAF4. La respuesta Th17 alivió la inflamación en nuestro modelo de ratón de influenza grave.

Las personas mayores tienen un mayor riesgo de influenza grave43. También sufrieron una mortalidad excesiva durante el SARS y las pandemias de COVID-19 en curso44,45, https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/need-extra-precautions/index.html; consultado el 23 de agosto de 2022. Sus comorbilidades contribuyen a este hecho, pero también puede implicar el trastorno del sistema inmunológico. La involución tímica relacionada con la edad y la disminución de la producción tímica pueden ser el problema. A los 50 años de edad, el timo humano genera solo del 15 al 20% de las células T en comparación con los jóvenes. Es casi incapaz de producir nuevas células T a la edad de 65 años (Ref: 46). La involución tímica comienza a partir de los tres meses de edad en ratones47. Las células Th17 que alivian la enfermedad mostraron los marcadores de superficie de emigrantes tímicos recientes. La timectomía abolió la respuesta Th17 y la Th17 disminuyó con la edad. Las personas mayores pueden sufrir una enfermedad grave debido a la pérdida de las células Th17 que modifican la enfermedad. Nuestros resultados generan alarmas con respecto a la modulación de la respuesta de IL-17 en infecciones graves del tracto respiratorio. Debemos ser cautelosos para evitar la manipulación inapropiada de citocinas, ya que la IL-17 no siempre es necesariamente proinflamatoria.

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el "Comité de uso y cuidado de animales" del Hospital Chang Gung Memorial (Número de aprobación: IACUC 2016030301). El comité certificó que todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Ley de Protección Animal del Consejo de Agricultura, Yuan Ejecutivo, Taiwán, República de China, y las pautas contenidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, tal como se promulgó. por el Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación, EE. UU.

Todos los ratones tenían antecedentes genéticos C57BL/10.D2, y para los experimentos se utilizaron ratones de 8 a 12 semanas de edad de ambos sexos, excepto en experimentos con ratones viejos. La línea de ratón transgénico TCR 6.5 expresa un TCR que reconoce un epítopo HA restringido por I-Ed (110SFERFEIFPKE120) de HA del virus de la influenza PR8 (generosamente proporcionado por H. Von Boehmer, Universidad de Harvard, Boston, MA). Los ratones 6.5 se cruzaron con ratones singénicos IL17KO o IL10KO para generar ratones transgénicos 6.5 IL17KO TCR o transgénicos 6.5IL10 KO TCR, respectivamente. Se generaron ratones singénicos IL17KO criando ratones IL17KO con antecedentes genéticos B6 (proporcionados generosamente por YC. Day, Chang Gung Memorial Hospital, Taiwán) en ratones con antecedentes genéticos C57BL/10.D2 durante >9 generaciones. Los ratones transgénicos Syngeneic IL10 KO y 6.5 IL10 KO TCR se describieron anteriormente18. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos.

La cepa PR8 (A/PR/8/34) del virus de la influenza se produjo en el líquido alantoideo de huevos de pollo embrionados de 10 días y se caracterizó en una instalación central en la Universidad Chang Gung, Taiwán. Los ratones se inocularon por vía intranasal durante la anestesia ligera con isoflurano (Aesica Queenborough Ltd., Kent, Reino Unido) con 2,5 × 103 unidades formadoras de placa (pfus) en 50 μl de PBS17,18,19,20,21,22,34.

El virus vaccinia insertado con HA48,49,50 se amplificó usando células BCS-1. Se inyectó intraperitonealmente una dosis infecciosa de 1 × 106 unidades formadoras de placa (pfus) en 100 μl de PBS.

La IL-17A de ratón recombinante (sin portador) se adquirió de BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.; Cat# 576006). Una concentración adecuada de IL-17A en 20 μl de PBS se complementó diariamente por vía intranasal durante 5 días durante la anestesia con isoflurano (Aesica Queenborough Ltd., Kent, Reino Unido).

El inhibidor de EGFR Gefitinib se adquirió de AstraZeneca. Primero se preparó una solución madre en DMSO y las alícuotas se mantuvieron a -80 °C. Cada día se preparó una solución final nueva en PBS y se administró por sonda oral 100 mg/kg de Gefitinib en 100 μl.

Se prepararon células T transgénicas TCR CD4+ específicas para HA clonotípicas a partir de bazos y ganglios linfáticos agrupados de ratones 6.5 transgénicos TCR CD4+ específicos para HA 17,18,19,20,21,22,34,48,49. Se prepararon linfocitos T transgénicos CD4+ TCR clonotípicos IL17 KO o IL10 KO HA a partir de bazos y ganglios linfáticos agrupados de 6,5 ratones transgénicos IL17 KO o 6,5 IL10 KO TCR, respectivamente. Los porcentajes clonotípicos se determinaron mediante análisis de citometría de flujo. El fenotipo ingenuo se confirmó evaluando los perfiles de activación de los marcadores CD44 (anti-ratón CD44; 553133, BD Biosciences; dilución = 1 en 100) y CD62L (anti-ratón CD62L; 553150, BD Biosciences; dilución = 1 en 100). Se recuperaron linfocitos T CD4+ 6.5 que respondían a la infección de los pulmones de ratones transgénicos 6.5 TCR CD4+ específicos para HA infectados. Las células T CD4+ se enriquecieron mediante selección negativa utilizando perlas magnéticas, y las células donantes se identificaron utilizando anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD90.1 (Thy1.1; anti-CD90.1 de ratón; 554898, BD Biosciences; dilución = 1 en 1000) o CD90.2 (Thy1.2; anti-ratón CD90.2; 553006; BD Biosciences; dilución = 1 en 200). Para los experimentos de transferencia de un solo lote, se inyectaron 2,5 × 106 células T CD4+ 6,5 clonotípicas a través de la vena de la cola en ratones receptores de tipo salvaje Thy1.2/Thy1.2+ en 0,2 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Para los experimentos de transferencia de dos lotes, se inyectó un primer lote de 0,5 × 106 linfocitos T clonotípicos 6,5 CD4+ en el momento de la infección, y un segundo lote de 1,5 × 106 linfocitos T clonotípicos 6,5 CD4+ se inyectó el día 4 de la infección en Thy1. 2/Thy1.2+ ratones de tipo salvaje.

Los linfocitos T clonotípicos (1 × 107 células/ml) se tiñeron con CFSE 5 μM (5, 6-carboxifluoresceína diacetatosuccinimidil éster; Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.) en HBSS durante 10 min. Las células se lavaron tres veces con HBSS, y las células T CD4+ 6,5 teñidas con CFSE (2,5 × 106) se transfirieron a través de la vena de la cola a los ratones receptores.

Las suspensiones celulares se incubaron en hielo con concentraciones saturadas de mAbs marcados con fluorocromo en tampón FACS (PBS más BSA al 0,5 % y NaN3 al 0,02 %) según lo recomendado por los fabricantes. Los linfocitos T CD4+ del donante se identificaron utilizando los siguientes mAb: anticlonotípico 6.5 TCR conjugado con biotina (proporcionado por H. Von Boehmer; dilución = 1 en 100), avidina-PE (A1204, Caltag, Burlingame, CA; dilución = 1 en 200), o Streptavidin-APC (SA 1005, Caltag, Burlingame, CA; dilución = 1 en 200), y anti-CD4 conjugado con PerCP o FITC (553052 o 553047, BD Biosciences; diluciones = 1 en 100 para ambos). Todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo eran de BD Biosciences, excepto T-bet, y control de isotipo IgG1κ de ratón (45–5825, 45–4714, eBiosciences; dilución = 1 en 50 para ambos), FITC-Phospho-EGFR (Tyr1068) Conejo antihumano, ratón (MA5-27995, Invitrogen; dilución = 1 en 10) y PE-TRAF4 (SC-390232, Santa Cruz Biotechnology; sin dilución). Las células se adquirieron usando FACS CALIBUR y el análisis se realizó usando el software CellQuest Pro (BD Biosciences), FACSuite (BD Biosciences) o FlowJo (Tree Star, Inc.).

Se reestimularon suspensiones de células individuales (5–10 × 106 células pocillo−1 en placas de 24 pocillos) de órganos recolectados durante 5 h con 10 µg·ml−1 de péptido HA restringido por MHC clase II (SFERFEIFPKE) en presencia de 5 µg·ml −1 Brefeldina A (SI-B7651, Sigma-Aldrich). La concentración de Brefeldin-A se mantuvo durante la tinción de citoquinas intracelulares. Las células reestimuladas se tiñeron en la superficie con anti-CD90.1 y anti-CD4 como se describió anteriormente, se fijaron en tampón de fijación IC (00–8222, eBiosciences), se lavaron y se tiñeron en tampón de permeabilización (00–8333, eBiosciences) que contenía anticuerpos conjugados con fluorocromo contra citocinas diana. Para Foxp3 (11–5773, eBiosciences; dilución = 1 en 50) y T-bet, las células se tiñeron en la superficie, se fijaron y se permeabilizaron en un tampón de fijación/permeabilización (00-5523, eBiosciences), se lavaron y se tiñeron en un tampón de permeabilización (00-8333, eBiosciences) que contiene anticuerpos conjugados con fluorocromos. En algunos experimentos, las células se analizaron ex vivo y se tiñeron sin reestimulación.

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de los bazos de ratones transgénicos 6.5 TRC específicos para HA. Los esplenocitos (2,5 × 105) se volvieron a estimular durante 72 h con péptido HA restringido de clase II (SFERFEIFPKE) a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. Se añadió timidina tritiada 18 h antes de la recolección. La cantidad de radiactividad incorporada en el ADN de cada pocillo se midió en un contador de centelleo, como se ha descrito anteriormente17,34. Co-cultivamos células T CD4+ específicas de HA que se infiltran en los pulmones recuperadas de ratones infectados como se describe en el texto, para medir su impacto en la proliferación.

Para la producción de citocinas, se estimularon suspensiones unicelulares de esplenocitos (2,5 × 106 células por pocillo) de ratones 6,5 competentes en IL-17 (IL-17+/+) con el virus de la influenza (cepa PR8; 0,03 (MOI) de multiplicidad de infección ) en RPMI-1640 completo durante 48 h in vitro, en presencia de linfocitos T CD4+ 6,5 específicos de HA que se infiltran en los pulmones de ratones infectados el día 4 en una proporción de 1:5. Los esplenocitos vírgenes sin células de los ratones infectados sirvieron como controles. Se añadió TGF-β de ratón recombinante (10 ng ml-1, GF346, Millipore) o anti-TGF-β (10 μgml-1, MAB1835, R&D) al cultivo al inicio. Se añadió péptido HA cognado (100 μgml-1) al cultivo durante las últimas 5 h. Se añadió Brefeldin-A durante las últimas 3 h de estimulación y luego se procesaron las células para la tinción intracelular.

Para la tinción con TRAF4, suspensiones unicelulares de esplenocitos (2,5 × 106 células por pocillo) de WT sin tratar, competentes para IL-17 (IL-17+/+) 6,5 o knockout para IL-17 (IL-17-/-) Se estimularon 6,5 ratones con virus de la gripe (cepa PR8; 0,03 (MOI) de multiplicidad de infección) en RPMI-1640 completo durante 48 h in vitro. Se añadió IL-17 de ratón recombinante (0,1 o 1,0 μgml−1; 576006, Biolegend) y/o Gefitinib (0,1 o 1,0 μgM; Iressa, AstraZeneca) al cultivo al inicio. Se añadió péptido HA cognado (100 μgml-1) al cultivo durante las últimas 5 h. Se agregó Brefeldin-A durante las últimas 3 h de estimulación y luego las células se procesaron de manera similar, como lo hicimos para la tinción intracelular.

Para la tinción de EGFR fosforilado, suspensiones unicelulares de esplenocitos (2,5 × 106 células por pocillo) de WT sin tratamiento previo, competentes para IL-17 (IL-17+/+) 6,5 o knockout para IL-17 (IL-17-/ −) Se estimularon 6,5 ratones con virus de la gripe (cepa PR8; 0,03 (MOI) de multiplicidad de infección) en RPMI-1640 completo durante 48 h in vitro. Se añadió IL-17 de ratón recombinante (0,1 o 1,0 μgml−1; 576006, Biolegend) y/o Gefitinib (0,1 o 1,0 μgM; Iressa, AstraZeneca) al cultivo al inicio. Se añadió péptido HA cognado (100 μgml-1) al cultivo durante las últimas 5 h. Se añadió Brefeldin-A durante las últimas 3 h de estimulación y luego se procesaron las células para la tinción. En resumen, las células se colocaron primero en tampón de permanente frío-III (558050, BD Biosciences) durante 30 min, se lavaron con tampón de tinción (554657, BD Biosciences) y se tiñeron con FITC-Phospho-EGFR (Tyr1068) Rabbit anti-Human, Ratón (MA5-27995, Invitrogen; dilución = 1 en 10) en tampón de tinción. Las células se adquirieron con BD LSRFortessa™ Cell Analyzer para citometría de flujo o se visualizaron en microscopía confocal (Leica).

Medimos los títulos de virus de influenza vivos en los órganos de ratones infectados usando un ensayo de placas de células renales caninas Madin-Darby modificadas (MDCK; The American Type Culture Collection), como se describió anteriormente17,18,19,20,21,22,34. Los órganos se recolectaron en los tiempos indicados en 1 mL de DMEM, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Se prepararon diluciones de diez veces de homogeneizados de tejido en DMEM suplementado con FCS al 10 %, antibiótico-antimicótico (15240-062, GIBCO BRL) y tripsina al 0,00025 %. Se añadió un total de 500 μl de cada dilución a monocapas confluentes de células MDCK en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 1 hora a 35 °C con 5 % de CO2. A continuación, cada pocillo recibió 2 ml de recubrimiento de agar (0,3 %) y se incubó durante 3 días. Las células se fijaron con formalina al 10 %, se eliminó la capa de agar y las monocapas fijadas se tiñeron con cristal violeta (0,02 % en etanol al 2 %). Los resultados se presentaron como unidades formadoras de placas (PFU)/ml = (número medio de placas × 2) × (factor de dilución −1).

Los pulmones de los ratones experimentales se recogieron el día 7 después de la infección y se fijaron con solución de formalina tamponada neutra al 10%. Después de la fijación, los pulmones se incluyeron en parafina y se cortaron secciones de 5 μm. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se puntuaron a ciegas. Los patólogos calificaron por separado la infiltración de células inflamatorias, incluidos linfocitos, neutrófilos y células plasmáticas, como negativa, 1+, 2+ o 3+ según la densidad de la infiltración. La vasculitis y la fibrosis también se calificaron como negativas, 1+, 2+ o 3+ según la gravedad, como se describió anteriormente17,18,19,20,21,22,34. La inflamación general en los pulmones estuvo representada por el promedio de estas puntuaciones.

Los datos se expresan como media ± sd Usamos Graphpad Prism versión 8 para los análisis de la prueba t de Student para comparar dos grupos en un momento específico. También analizamos ANOVA de dos vías para las curvas de peso corporal y la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para las curvas de supervivencia. Se consideraron significativos los valores de p < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos de origen numéricos para los gráficos se pueden encontrar en Datos Suplementarios 1.

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Agradecemos al Laboratorio Central de Investigación de Radiación del Hospital Chang Gung Memorial por el apoyo del instrumento de citometría de flujo. El Centro de Investigación de Infecciones Virales Emergentes recibe apoyo del Programa del Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Brote de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE), Taiwán y NSTC 111−2634-F-182-001 de la National Science y Consejo de Tecnología, Taiwán. Este trabajo fue apoyado por los proyectos MOST 111-2314-B-182-029 (AD), MOST-105-2321-B-182A-003-MY3 (AD) y MOST-106-2314-B-182A-160- MY3 (CTH) del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán, y por CMRPVVJ0052 (CYH), CMRPG 3E2081-3 y 3J0721 (CTH) del Medical Research Project Fund, Chang Gung Memorial Hospital, Taiwán.

Centro de Investigación de Infecciones Virales Emergentes, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Guishan-33302, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Avijit Dutta

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Guishan-33333, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Avijit Dutta, Sung-Han Hsiao, Chia-Shiang Chang y Ching-Tai Huang

División de Medicina Torácica, Departamento de Medicina, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Guishan-33333, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Chen-Yiu Hung

Departamento de Patología, Hospital Memorial Chang Gung, Guishan-33333, ciudad de Taoyuan, Taiwán

Tse Ching Chen

Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Guishan-33302, ciudad de Taoyuan, Taiwán

Tse Ching Chen

División de Hematología y Oncología, Departamento de Medicina, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Guishan-33333, ciudad de Taoyuan, Taiwán

Yung-Chang Lin

División de Hematología y Oncología, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Guishan-33302, ciudad de Taoyuan, Taiwán

Yung-Chang Lin

División de Hepatogastroenterología, Departamento de Medicina, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Guishan-33333, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Chun Yen Lin

División de Hepatogastroenterología, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Guishan-33302, ciudad de Taoyuan, Taiwán

Chun Yen Lin

División de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Guishan-33302, ciudad de Taoyuan, Taiwán

Ching-Tai Huang

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AD y C.-TH diseñaron los estudios de investigación, analizaron los datos y redactaron el artículo; T.-CC realizó la puntuación patológica de las secciones de pulmón; AD, C.-YH, S.-HH, C.-SC, T.-AC, Y.-CL y C.-YL realizaron la investigación.

Correspondencia a Ching-Tai Huang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Hugh D Mitchell y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Damon Tumes, Eve Rogers y Christina Karlsson Rosenthal. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Dutta, A., Hung, CY., Chen, TC. et al. Un eje IL-17-EGFR-TRAF4 contribuye al alivio de la inflamación pulmonar en la gripe grave. Comun Biol 6, 600 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04982-0

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Recibido: 11 Septiembre 2022

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04982-0

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