Raro mejorado

Nature volumen 618, páginas 87–93 (2023)Citar este artículo

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Detalles de métricas

Los elementos de tierras raras tecnológicamente críticos son notoriamente difíciles de separar, debido a sus sutiles diferencias en el radio iónico y el número de coordinación1,2,3. La proteína natural de unión a lantánidos lanmodulina (LanM)4,5 es una alternativa sostenible a la separación convencional basada en la extracción con disolventes6. Aquí caracterizamos un nuevo LanM, de Hansschlegelia quercus (Hans-LanM), con un estado oligomérico sensible al radio iónico de tierras raras, el dímero inducido por lantano (III) es > 100 veces más apretado que el inducido por disprosio (III). dímero Las estructuras cristalinas de rayos X ilustran cómo las diferencias de escala de picómetro en el radio entre el lantano (III) y el disprosio (III) se propagan a la estructura cuaternaria de Hans-LanM a través de un cambio de carboxilato que reorganiza una red de enlaces de hidrógeno de segunda esfera. La comparación con el LanM prototipo de Methylorubrum extorquens revela distintas estrategias de coordinación de metales, lo que racionaliza la mayor selectividad de Hans-LanM dentro de los elementos de tierras raras. Por último, la mutagénesis guiada por la estructura de un residuo clave en la interfase del dímero Hans-LanM modula la dimerización en solución y permite la separación basada en una columna de una sola etapa de una mezcla de neodimio (III)/disprosio (III) hasta purezas de elementos individuales >98 % . Este trabajo muestra la diversidad natural de motivos de reconocimiento de lantánidos selectivos y revela la dimerización sensible a tierras raras como un principio biológico mediante el cual ajustar el rendimiento de los procesos de separación basados ​​en biomoléculas.

Las funciones insustituibles de los elementos de tierras raras (RE) en las tecnologías modernas omnipresentes que van desde los imanes permanentes hasta los diodos emisores de luz y los fósforos han renovado el interés en uno de los grandes desafíos de la ciencia de la separación: la separación eficiente de los lantánidos1. La separación de estos 15 elementos se complica por las propiedades fisicoquímicas similares de sus iones +III predominantes, con radios iónicos que disminuyen solo 0,19 Å entre LaIII y LuIII (ref. 7), lo que también lleva a que estos metales coexistan en RE-bearing minerales Los métodos de extracción líquido-líquido hidrometalúrgicos convencionales para la producción de ER utilizan solventes orgánicos como el queroseno y extractantes de fosfonato tóxico y requieren docenas o incluso cientos de etapas para lograr óxidos de ER individuales de alta pureza3,8. La ineficiencia y el gran impacto ambiental de las separaciones de RE9 han estimulado los esfuerzos de investigación sobre ligandos alternativos con factores de separación más grandes entre RE adyacentes10,11,12,13,14 y diseños de procesos más ecológicos para lograr la separación de RE en menos etapas15 y usando química totalmente acuosa6, 16,17,18,19,20.

El descubrimiento del miembro fundador de la familia LanM de proteínas de unión a lantánidos demostró que la naturaleza ha desarrollado macromoléculas que superan la selectividad de los quelantes sintéticos del elemento f4. El LanM prototipo, de M. extorquens AM1 (Mex-LanM), es una proteína monomérica pequeña (12 kDa) que sufre una respuesta conformacional selectiva a concentraciones picomolares de lantánidos4,18 y actínidos21,22,23,24, ha facilitado comprensión de la captación de lantánidos en metilotrofos25, y ha servido como plataforma tecnológica para la detección26, recuperación18,27 y separación6 de elementos f. Inusualmente entre los quelantes de RE, Mex-LanM favorece los RE ligeros (LRE) más grandes y abundantes, especialmente LaIII–SmIII, sobre los RE pesados ​​(HRE)4. Nuestra demostración reciente de que incluso las sustituciones individuales en los motivos de unión a metales de Mex-LanM pueden mejorar las separaciones de actínidos/lantánidos23 nos impulsó a investigar si los ortólogos de Mex-LanM podrían poseer tendencias de selectividad de metales distintas y potencialmente útiles.

En este documento, informamos que el LanM de Hansschlegelia quercus (Hans-LanM), una bacteria metilotrófica aislada de yemas de roble inglés28, exhibe una mayor capacidad de separación de RE en relación con Mex-LanM. Mientras que Mex-LanM siempre es monomérico, Hans-LanM existe en un equilibrio monómero/dímero, cuya posición depende del enlace RE específico. Tres estructuras cristalinas de rayos X de LanMs y la mutagénesis guiada por estructura explican el estado oligomérico dependiente de RE de Hans-LanM y su mayor capacidad de separación que la de Mex-LanM. Finalmente, aprovechamos estos hallazgos para lograr una separación basada en Hans-LanM de una sola etapa del par crítico de neodimio/disprosio. Estos resultados ilustran cómo las interacciones intermoleculares, comunes en proteínas pero raras en moléculas pequeñas, pueden aprovecharse para mejorar las separaciones de RE.

Hemos propuesto4 varios sellos distintivos de un LanM. En primer lugar, los LanM poseen cuatro motivos de mano EF. Las manos EF comprenden bucles de unión a metales ricos en carboxilatos de 12 residuos flanqueados por hélices α, que tradicionalmente responden a la unión de CaII; afinidad y selectividad de 108 veces sobre CaII, lo que da como resultado una gran transición conformacional de desorden a orden selectiva de lantánidos4. EF4 se une solo con afinidad micromolar. En segundo lugar, las manos EF adyacentes en LanM están separadas por 12 a 13 residuos, en lugar de los típicos ≈25 residuos en las proteínas de mano EF sensibles a CaII, lo que da como resultado una arquitectura de haz de tres hélices inusual con los sitios de unión al metal en la periferia5. En tercer lugar, al menos una mano EF contiene prolina en la segunda posición (en Mex-LanM, las cuatro manos EF presentan residuos P2). Realizamos búsquedas en bases de datos de secuencias utilizando los dos primeros criterios y una longitud de secuencia de <200 residuos, identificando 696 LanM putativos. Estas secuencias se visualizaron utilizando una red de similitud de secuencias30 para identificar las secuencias de LanM que se agrupan por separado de Mex-LanM. En particular, en un umbral de identidad del 65%, se forma un pequeño grupo de secuencias que está alejado del grupo principal de 642 secuencias (Fig. 1a). Este grupo exclusivo (el grupo de Hans) incluye bacterias de varios géneros, incluidos Hansschlegelia y Xanthobacter (Datos ampliados, Fig. 1), todos los cuales son metilotrofos facultativos31.

a, La red de similitud de secuencias de las secuencias centrales de LanM indica que Hans-LanM forma un grupo distinto. La red de similitud de secuencias incluye 696 secuencias LanM conectadas con 48 647 bordes, con un umbral en un valor BLAST E de 1 × 10−5 y una identidad de secuencia del 65 %. La caja negra encierra nodos agrupados con Hans-LanM. La secuencia LanM asociada con Mex (triángulo descendente) y cuatro dentro de Hansschlegelia (triángulo ascendente) se amplían en comparación con otros nodos (círculos). Los colores de los nodos representan la familia a partir de la cual se originan las secuencias. b, Comparación de las secuencias de las cuatro manos EF de Mex- y Hans-LanMs. Los residuos involucrados canónicamente en la unión de metal en las manos de EF están en azul; Los residuos profesionales están en púrpura. c, Espectros de dicroísmo circular de una titulación representativa de Hans-LanM con LaIII, que muestran la helicidad creciente de la respuesta conformacional asociada al metal; la apoproteína está en negro negrita, la proteína saturada con LaIII está en rojo negrita. d, Titulación de dicroísmo circular de Hans-LanM con LaIII, NdIII y DyIII (pH 5,0). Cada punto representa la media ± sd de tres experimentos independientes. e, Comparación de los valores de Kd,app (pH 5,0) para Mex-LanM (negro 18) y Hans-LanM (rojo), representados frente al radio iónico7. Media ± sem de tres experimentos independientes.

Datos fuente

Hans-LanM presenta una identidad de secuencia baja (33%) con Mex-LanM (Fig. 1 complementaria) y motivos de mano EF divergentes, particularmente en las posiciones primera, segunda y novena (Fig. 1b), que son posiciones importantes en Mex- LanM23,26 y otras proteínas EF-hand29. Por lo tanto, Hans-LanM presentó una oportunidad para determinar las características esenciales para el reconocimiento selectivo de lantánidos en LanMs.

Hans-LanM se expresó en Escherichia coli como una proteína de 110 aminoácidos (Fig. 1 complementaria). LaIII y NdIII se seleccionaron como LRE representativos y DyIII se seleccionó como HRE representativo para estudios de complejación. La proteína se une a aproximadamente tres equivalentes de LaIII y NdIII, y un poco menos de DyIII, mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (Tabla complementaria 1), al igual que Mex-LanM4. También como Mex-LanM4, Hans-LanM exhibe poco contenido helicoidal en ausencia de metal, a juzgar por la señal de dicroísmo circular a 222 nm (Fig. 1c). Inesperadamente, solo dos equivalentes de LaIII o DyIII fueron suficientes para causar el cambio conformacional completo de Hans-LanM (Fig. 2 complementaria), lo que indica que el tercer equivalente de unión es débil y no aumenta la helicidad.

Las constantes de disociación aparentes (Kd,app) determinadas por espectroscopía de dicroísmo circular4 reflejan las selectividades RE versus RE y RE versus no RE de Mex-LanM en condiciones competitivas de recuperación de RE6,18. Por lo tanto, se aplicaron a Hans-LanM determinaciones similares de Kd,app con concentraciones de metales libres controladas por un quelante competitivo4,32; los resultados (Fig. 1d y Tabla complementaria 2) divergieron de los de Mex-LanM. La unión de LaIII y NdIII a Hans-LanM aumenta la elipticidad molar a 222 nm en 2,3 veces, siendo evidente el cambio conformacional completo en las valoraciones estequiométricas. El cambio conformacional es cooperativo (coeficientes de Hill, n, de 2; Tabla complementaria 2), y los valores de Kd, app son similares, 68 y 91 pM, respectivamente. Por el contrario, aunque DyIII induce la misma respuesta general que LaIII en valoraciones estequiométricas (Fig. 2 complementaria), en las valoraciones DyIII tamponadas con quelante, Hans-LanM exhibe una respuesta conformacional menor (aumento de 1,8 veces). Esta diferencia indica que al menos uno de los sitios de unión a DyIII tiene una respuesta muy débil (Kd,app > 0,3 µM, la concentración más alta accesible en las titulaciones tamponadas con quelante). La principal respuesta a DyIII se produce a 2,6 nM, >30 veces mayor que con los LRE y con poca o ninguna cooperatividad (n = 1,3). Por el contrario, Mex-LanM muestra solo una modesta preferencia por los LRE (alrededor de cinco veces; Fig. 1e; ref. 4), y todos los lantánidos y YIII inducen cambios conformacionales y cooperatividad similares. Hans-LanM responde débilmente al calcio (II) (Kd, app = 60 µM), con la misma falta de cooperatividad (n = 1,0) y un cambio conformacional parcial evidente con DyIII (datos ampliados, Fig. 2). Por lo tanto, Hans-LanM discrimina más fuertemente entre LRE y HRE que Mex-LanM, y los complejos HRE exhiben menor afinidad, menor cooperatividad y un menor cambio conformacional primario.

Los distintos comportamientos de los complejos LRE y HRE-Hans-LanM sugirieron mecanismos de selectividad LRE versus HRE que no están presentes en Mex-LanM. Como Mex-LanM es un monómero en complejo con LRE y HRE por igual4,5, consideramos que LRE y HRE podrían inducir diferentes estados oligoméricos en Hans-LanM. En presencia de tres equivalentes de LaIII, Hans-LanM eluye de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) no con el peso molecular esperado (MW) de 11,9 kDa, sino con 27,8 kDa, lo que sugiere un dímero (Figs. 3 complementarias y 4a). Comenzando gradualmente después de NdIII pero bruscamente en GdIII, el PM aparente disminuye hacia el esperado para un monómero (Fig. 2a, Fig. 4 complementaria y Tabla 3 complementaria). En particular, los lantánidos más pesados ​​que GdIII no parecen apoyar el crecimiento de bacterias que utilizan RE33,34,35.

a, Peso molecular aparente de los complejos Hans-LanM con RE según lo determinado por SEC analítico (líneas rojas) o SEC-MALS (línea discontinua negra). Consulte la Tabla complementaria 1 para conocer las condiciones. Cada punto de datos individual es el resultado de un único experimento. b, El dímero Hans-LanM unido a LaIII determinado por cristalografía de rayos X. Los iones LaIII se muestran como esferas verdes y los iones NaI se muestran como esferas grises. c, Vista detallada de la interfaz del dímero cerca de EF3 de la cadena A (caricatura azul). Arg100 de la cadena C (dibujo azul claro) ancla una red de enlaces de hidrógeno que involucra a Asp93 de la cadena A y dos ligandos EF3 LaIII (Glu91 y Asp85). Estas interacciones constituyen los únicos contactos polares en la interfaz del dímero, proporcionando un medio para controlar el radio del sitio de unión de los lantánidos en EF3. d, Esquema de las interacciones en la interfaz del dímero. Las líneas discontinuas rojas indican interacciones de enlaces de hidrógeno y las líneas discontinuas grises indican contactos hidrofóbicos. e, Proyecciones DENSS de densidad de electrones a partir de conjuntos de datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño para Hans-LanM ligado a LaIII (izquierda) y ligado a DyIII (derecha), superpuesto con un diagrama de cinta generado por PyMOL del dimérico LaIII–Hans-LanM estructura cristalina.

Para proporcionar más apoyo para la dimerización preferencial en presencia de LRE fisiológicamente relevantes, los complejos RE de Hans-LanM se analizaron mediante dispersión de luz multiángulo (MALS; Fig. 2a y Fig. 5 complementaria). Los complejos LaIII, NdIII y GdIII tienen PM de 22–25 kDa, indicativos de dímeros, pero los PM disminuyen a partir de TbIII y continúan con DyIII y HoIII, a aproximadamente 15 kDa (Tabla 1 de datos ampliados), de acuerdo con los datos de la SEC. Hans-LanM unido a CaII también indicó un PM de 14,7 kDa. Sin embargo, los complejos HRE–, CaII– y apo Hans-LanM son todavía un tercio más grandes de lo esperado para un monómero, lo que sugiere que estas formas existen en un equilibrio rápido con una relación monómero/dímero de ≈2:1 en estas condiciones. A continuación, determinamos el Kd para la dimerización (Kdimer) de apo, Hans-LanM unido a LaIII y unido a DyIII mediante calorimetría de titulación isotérmica (Tabla de datos extendida 2 y Figs. 6-8 complementarias). La apoproteína y la proteína unida a DyIII se dimerizan débilmente, con valores de dímero K de 117 µM y 60 µM, respectivamente, en consonancia con las proporciones de monómero y dímero reflejadas en las trazas de SEC y MALS. Sin embargo, en presencia de LaIII, el dímero estaba demasiado apretado para poder observar la monomerización mediante calorimetría de titulación isotérmica, lo que indica que Kdimer <0.4 µM (Fig. 8 complementaria). Por lo tanto, LaIII favorece la dimerización de Hans-LanM en >100 veces más que DyIII.

Una estructura cristalina de rayos X de 1,8 Å de resolución de Hans-LanM en complejo con LaIII confirma la dimerización inducida por LRE (datos extendidos, figura 3 y tabla complementaria 4). Dos monómeros LanM interactúan de cabeza a cola (Fig. 2b), enterrando alrededor de 600 Å2 de área superficial a través de contactos hidrofóbicos y polares (Fig. 2c, d). Estas interacciones ocurren en gran medida entre las cadenas laterales aportadas por las hélices centrales α1 (entre EF1 y EF2) y α2 (entre EF3 y EF4; Fig. 9 complementaria). Los residuos en la interfaz del dímero hacen contacto directo con solo uno de los cuatro sitios de unión a metales, EF3; tres residuos de EF3 en cada monómero forman una red de enlaces de hidrógeno con Arg100 del otro monómero (Fig. 2c), lo que sugiere que la geometría de ocupación y coordinación en este sitio puede controlar el estado oligomérico.

Hans-LanM y sus complejos con tres equivalentes de LaIII, NdIII y DyIII también se analizaron mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (Figuras complementarias 10 y 11). Las envolturas de solvente calculadas36 a partir de los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño se ajustan bien al dímero cristalográfico Hans-LanM para LaIII-Hans-LanM, adecuadamente para NdIII-Hans-LanM, pero mal para DyIII-Hans-LanM (Fig. 2e y figuras complementarias 12-14). La dimerización más débil de DyIII-Hans-LanM también está respaldada por métricas cuantitativas, como el volumen de Porod (Figuras complementarias 15 y 16 y Tablas complementarias 5 y 6). Juntos, los resultados bioquímicos y estructurales indican que el equilibrio de dimerización de Hans-LanM depende en gran medida del enlace RE particular.

La estructura de LaIII-Hans-LanM también proporciona una de las primeras vistas detalladas de los entornos de coordinación en un LanM y, de hecho, cualquier biomolécula natural encargada del reconocimiento reversible de lantánidos. La estructura de RMN anterior de Mex-LanM5 reveló el pliegue inusual de la proteína, pero no pudo proporcionar detalles a nivel molecular sobre los sitios de unión a metales. Para comprender la base de la discriminación entre LRE y HRE, también determinamos una estructura de resolución de 1,4 Å de DyIII-Hans-LanM. Finalmente, informamos una estructura de resolución de 1,01 Å de NdIII–Mex-LanM, que racionaliza la tendencia de selectividad RE menos profunda de Mex-LanM4.

En LaIII–Hans-LanM, EF1–3 están ocupados por iones LaIII (Datos extendidos Fig. 3b–e). EF4 es estructuralmente distinto, no exhibe densidad de diferencia anómala consistente con LaIII y se modeló con NaI (Fig. 17a complementaria). Cada sitio de unión a LaIII tiene diez coordenadas, como se observa en estructuras de metanol deshidrogenasas dependientes de lantánidos33,37 (Fig. 18 complementaria). Un Asn monodentado (posición N1), cuatro residuos Asp o Glu bidentados (D3, D5, E9 y E12) y un carbonilo principal (T7 o S7) completan la primera esfera de coordinación en EF1–3 (Fig. 3a). No se observan ligandos de solventes exógenos (Fig. 17b complementaria); los estudios de luminiscencia de EuIII-Hans-LanM para determinar el número de moléculas de solvente coordinadas (q) arrojaron q = 0.11, consistente con la ausencia de ligandos de solvente en la estructura de rayos X (Fig. 19 complementaria).

a, Vistas ampliadas de EF2 (izquierda) y EF3 (derecha) en LaIII–Hans-LanM. Los iones LaIII se muestran como esferas verdes. Los enlaces de coordinación y los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas. Los residuos aportados por la cadena A se muestran en azul y los aportados por la cadena C (en el caso de EF3) se muestran en azul claro. Recuadro: superposición de LaIII–Hans-LanM (azul y azul claro) con DyIII–Hans-LanM (gris), que muestra el cambio de carboxilato de Glu91 de bidentado (La) a monodentado (Dy). La coordinación y los enlaces de hidrógeno (líneas discontinuas) se muestran solo para el caso Dy. b, Sitio representativo de unión a metales (EF3) en NdIII–Mex-LanM. El ion NdIII se muestra como una esfera de agua. Las moléculas de disolvente se muestran como esferas rojas.

Los sitios de unión de lantánidos en Hans-LanM además comparten extensas interacciones de segunda esfera que pueden restringir aún más las posiciones de los ligandos y el tamaño del poro de unión al metal (Fig. 20 complementaria). Este fenómeno es más evidente en EF3, en el que la interfaz de dímero media una red extendida de enlaces de hidrógeno que involucra varios ligandos. Arg100, aportado por el monómero adyacente, se proyecta en el lado expuesto al solvente de EF3 para contactar dos ligandos de carboxilato, Asp85 (D3) y Glu91 (E9), reforzando sus modos de unión bidentados. Arg100 también está respaldado por Asp93 (EF3 D11), exclusivo de EF3 dentro de Hans-LanM y no observado en Mex-LanM. Probamos la importancia de esta red en la dimerización de Hans-LanM haciendo la sustitución mínima, R100K. Hans-LanM (R100K) tenía valores de Kd, aplicación y respuesta a NdIII y DyIII casi idénticos a los de Hans-LanM de tipo salvaje, pero la Kd, aplicación para LaIII era dos veces más débil (Fig. 21 complementaria y Tabla complementaria 7). El análisis SEC-MALS indicó PM de 10–13 kDa para apo, LaIII– y DyIII–Hans-LanM(R100K) (Figura 22 complementaria y Tabla complementaria 8), lo que indica una mayor monomerización, especialmente para el complejo LaIII, y sugiere que una dimerización más débil puede ser responsable de la menor afinidad por LaIII. Los cuatro residuos que componen la red Arg100-EF3 están completamente conservados en el grupo de Hans (Fig. 23 complementaria), lo que sugiere que estas interacciones pueden contribuir a la dimerización en estos LanM.

La estructura de DyIII-Hans-LanM confirma la importancia del control de la segunda esfera del posicionamiento del ligando (Datos extendidos Fig. 4, Figs. complementarias 24-26 y Tablas complementarias 9 y 10). La estructura general de DyIII-Hans-LanM es en gran parte superponible con la de LaIII-Hans-LanM, y las esferas de coordinación de los iones DyIII en EF1-3 son similares a las de LaIII-Hans-LanM (Fig. 3a, recuadro) , con la notable excepción de E9 (por ejemplo, Glu91 en EF3). Este residuo cambia de bidentado con LaIII a monodentado con los iones DyIII más pequeños, produciendo una geometría antiprismática cuadrada cubierta distorsionada de nueve coordenadas; el menor número de coordinación con un ion HRE es consistente con el caso de otros complejos RE38,39. En EF3, este cambio de carboxilato alarga la distancia entre Arg100 y el Oε proximal de Glu91 de 2,9 Å (en LaIII-Hans-LanM) a 3,2 Å (Fig. 27 complementaria). La reorganización de esta red de enlaces de hidrógeno de la segunda esfera sugiere una base estructural para las diferencias dependientes de RE en los valores de Kdimer.

Los sitios de unión a metales de Mex-LanM difieren sustancialmente de los de Hans-LanM. En Mex-LanM, las cuatro manos EF están ocupadas por iones NdIII de nueve coordenadas (EF1-3) o diez coordenadas (EF4), cada uno de los cuales incluye dos ligandos solventes, que no están presentes en Hans-LanM (Fig. 3b y Fig. 28). La observación de las dos moléculas de disolvente por sitio metálico y el enlace de hidrógeno con el residuo D9 valida estudios espectroscópicos recientes21,23,26. La diferencia en el número de coordinación entre EF1–3 y EF4 se debe a que el carboxilato D3 es monodentado en EF1–3 pero bidentado en EF4. Aunque los sitios NdIII de Mex-LanM comparten la coordinación nueve y diez observada en DyIII– y LaIII–Hans-LanM, se asemejan estructuralmente a los sitios de unión a CaII de siete coordenadas de la calmodulina (Fig. 18 complementaria). Los números de coordinación aumentados en Mex-LanM en relación con la calmodulina resultan de la coordinación bidentada de D5 y un ligando solvente adicional. Estas similitudes sugieren que gran parte de la selectividad única de 108 veces de LanM para REs sobre CaII resulta de diferencias sutiles en la segunda esfera de coordinación y otras interacciones más distales. Finalmente, la primera esfera de coordinación derivada exclusivamente de proteínas en Hans-LanM, particularmente debido a la coordinación por E9, produce redes de enlaces de hidrógeno más extendidas (Figuras complementarias 20 y 29) y probablemente mejora el control sobre el radio del sitio de unión. Por lo tanto, las estructuras racionalizan la extraordinaria selectividad RE versus no RE de Mex-LanM y Hans-LanM al mismo tiempo que explican sus diferencias en la selectividad LRE versus HRE.

Las diferencias en la estabilidad y la estructura entre los complejos LRE y HRE de Hans-LanM sugirieron que Hans-LanM (tipo salvaje y/o R100K) superaría a Mex-LanM en las separaciones RE/RE. Nos enfocamos en separar el par RE de NdIII y DyIII usado en imanes permanentes. En primer lugar, analizamos las estabilidades de los complejos de tipo salvaje Hans-LanM y Hans-LanM(R100K) RE frente al citrato, que se había utilizado previamente como desorbente con Mex-LanM6. Los complejos RE-Hans-LanM son generalmente menos estables contra el citrato que los de Mex-LanM, como se esperaba sobre la base de una menor afinidad (Fig. 1e), pero la diferencia en la estabilidad entre NdIII-Hans-LanM y DyIII-Hans- Los complejos LanM, expresados ​​como la proporción de la concentración de citrato requerida para la desorción del 50% de cada metal ([citrato] 1/2), según lo informado por la fluorescencia de los dos residuos Trp de Hans-LanM (Fig. 30 complementaria), es dos veces mayor que para complejos Mex-LanM (Fig. 4a, Tabla complementaria 11 y Datos extendidos Fig. 5). Además, la sustitución R100K desestabiliza significativamente el complejo LaIII de Hans-LanM contra el citrato, mientras que solo afecta ligeramente al complejo NdIII y no afecta al complejo DyIII. Este resultado confirma que la dimerización estabiliza selectivamente los complejos LRE de Hans-LanM (y especialmente el complejo LaIII), un factor anulado por la sustitución R100K. Usando malonato, un quelante más débil que el citrato, DyIII se puede desorber fácilmente tanto de Hans-LanM como de R100K con un quelante 10–100 mM sin una desorción significativa de NdIII, lo que sugiere condiciones para la separación de NdIII/DyIII (Fig. 4b).

a, Hans-LanM y la variante R100K muestran mayores diferencias en la estabilidad del complejo Nd frente a Dy que Mex-LanM frente a la desorción por citrato. Media ± sem para tres ensayos independientes. **La diferencia significativa entre [citrato]1/2 para LaIII entre Hans-LanM y Hans-LanM(R100K) (proteína 20 µM) muestra el impacto de la dimerización de la estabilidad del complejo LaIII (P < 0,01, análisis de varianza con Bonferroni post- prueba). Mex-LanM Nd y Dy datos de ref. 6. b, valoración espectrofluorométrica de la variante Hans-LanM y R100K (λex = 280 nm, λem = 333 nm) a pH 5,0, que representa la desorción inducida por malonato de un complejo metal-proteína 2:1. Media ± sem para tres ensayos independientes, excepto aquellos con R100K, que fueron ensayos únicos de cada condición. c, Comparación de los factores de distribución (pH 5,0, alrededor de 0,33 mM cada RE, LaIII–DyIII) para Hans-LanM, Hans-LanM(R100K) y Mex-LanM inmovilizados. Cada punto representa la media ± sd para tres ensayos independientes. d, Separación de una mezcla 95:5 de NdIII/DyIII utilizando Hans-LanM(R100K) inmovilizado y un esquema de desorción de tres concentraciones escalonadas de malonato seguido de pH 1,5 HCl. El volumen de un lecho era de 0,7 ml.

Datos fuente

Aunque una modulación doble de la selectividad de RE frente a RE por dimerización puede parecer pequeña, tales diferencias brindan la oportunidad de disminuir el número de etapas de separación, aumentando la eficiencia de un proceso de separación3,12. Por lo tanto, Hans-LanM y la variante R100K se inmovilizaron a través de un residuo de Cys carboxi-terminal en perlas de agarosa funcionalizadas con maleimida, como se describió anteriormente6, y se analizaron para determinar la separación de NdIII/DyIII. Hans-LanM inmovilizado se unió a aproximadamente un equivalente de RE, a diferencia de la solución y se comparó con dos equivalentes para Mex-LanM6 y Hans-LanM (R100K) (Fig. 31 complementaria). Hans-LanM y R100K exhibieron una capacidad de separación similar en el rango La–Gd, aunque R100K exhibe una mayor capacidad de separación en el rango Gd–Dy, según lo determinado por las proporciones de distribución en columna (D) de una solución mixta de ER en equilibrio (Fig. 4c, Tabla de datos extendida 3 y Tablas complementarias 12–14). Estos factores de separación Nd/Dy son casi el doble (Hans-LanM) y el triple (Hans-LanM(R100K)) que los de Mex-LanM (Tabla 3 de datos ampliados). El Hans-LanM inmovilizado se cargó al 90 % de su capacidad de avance con una mezcla de desechos electrónicos modelo de 5 % de disprosio y 95 % de neodimio y, guiado por la Fig. 4b, se eluyó con un gradiente de malonato corto y escalonado, seguido de una desorción completa con un pH de 1,5. HCl. En una sola etapa de purificación, Dy se mejoró del 5 % al 83 % de pureza y el Nd se recuperó con una pureza del 99,8 % (ambos >98 % de rendimiento; Datos ampliados, Fig. 6). Esto superó significativamente el proceso comparable basado en Mex-LanM, que logró solo un 50 % de pureza en una primera etapa de separación y requirió una segunda etapa para obtener una pureza >98 %6. La variante R100K inmovilizada se desempeñó aún mejor, logrando una separación de referencia de DyIII y NdIII con una pureza >98 % y un rendimiento >99 % en una sola etapa (Fig. 4d). El mejor rendimiento de la variante R100K fue inesperado y puede señalar la improbabilidad de dímeros funcionales en la columna con esta densidad de inmovilización (consulte el título de Datos extendidos, Fig. 6 para una discusión). Por lo tanto, a pesar de un rendimiento sustancialmente mejorado frente a Mex-LanM habilitado por la caracterización del mecanismo de dimerización de Hans-LanM, explotar completamente el fenómeno de dimerización en la columna puede implicar, por ejemplo, la unión de dos monómeros en una sola cadena polipeptídica, que está bajo investigación.

La caracterización bioquímica y estructural del mecanismo de dimerización sensible al metal de Hans-LanM proporciona un nuevo mecanismo alostérico para la selectividad de LRE frente a HRE en biología, que amplía los conceptos de reconocimiento de metales dependientes de dímeros que recientemente surgieron de complejos de lantánidos sintéticos11 y proteínas de unión a metales de transición diseñadas40 y mostrando que estos principios están integrados en la naturaleza. Nuestro trabajo también muestra que la fuerza de dimerización y, por lo tanto, la selectividad del metal, se pueden modular racionalmente. Hans-LanM desarrolló una dimerización selectiva de LRE a concentraciones de proteínas fisiológicas más cercanas a las de nuestros ensayos bioquímicos (10–20 µM) en lugar de las de la columna (alrededor de 3 mM). Por lo tanto, se ayudaría a aprovechar la dimerización en un proceso de separación cambiando la sensibilidad de la dimerización al régimen de mayor concentración, como ajustando las interacciones hidrofóbicas en la interfaz de dimerización. Además, nuestros estudios establecen que los LanM con una identidad tan baja como el 33 % se predicen fácilmente, pero tienen diferencias útiles en la selectividad del metal; la extracción adicional de esta diversidad puede revelar mecanismos adicionales para ajustar las separaciones de RE. Finalmente, las esferas de coordinación excluidas del solvente de Hans-LanM deberían superar a Mex-LanM en separación de RE/actínidos23, detección basada en luminiscencia21,26 y estabilización de iones propensos a la hidrólisis. La caracterización continua de los principios supramoleculares y de coordinación del reconocimiento biológico del elemento f inspirará el diseño de ligandos con selectividades más altas de RE frente a RE y su implementación en nuevos procesos de separación de RE.

Consulte los Métodos complementarios para obtener más información.

La secuencia de LanM de M. extorquens AM1 se utilizó como consulta para realizar búsquedas PSI-BLAST en las bases de datos de secuencias de proteínas no redundantes (nr) y proteínas metagenómicas (env_nr) del Centro Nacional de Información Biotecnológica hasta la convergencia41. Las 3047 secuencias de proteínas resultantes se seleccionaron manualmente para aquellas que tienen menos de 200 residuos, tienen al menos un par de manos EF separadas por menos de 14 residuos y tienen 4 manos EF. Los péptidos señal de las secuencias de LanM se predijeron utilizando SignalP (v6.0)42 y luego se eliminaron antes del análisis adicional de las secuencias.

Se usó la iniciativa de función enzimática-herramienta de similitud de enzimas para calcular las similitudes entre todos los pares de secuencias de péptidos con un umbral de valor E de 1 × 10−5 (ref. 30). La red de similitud de secuencia resultante de 696 nodos y 241 853 bordes se construyó y exploró utilizando el diseño orgánico a través de Cytoscape (v3.9.1)43 y se visualizó en R (v4.1.0)44. El umbral de identidad del porcentaje de borde se incrementó gradualmente del 40 % al 90 % para generar grupos distintos.

Las secuencias de LanM se alinearon utilizando MUSCLE (v5.1)45 con parámetros predeterminados. El modelo utilizado para la construcción de la filogenia se seleccionó mediante ModelFinder en IQ-TREE (v2.2.0.3)46,47 con --mset establecido en bestia2. La filogenia bayesiana se generó sobre la base de estos resultados usando BEAST (v2.6.7)48. La filogenia resultante se evaluó usando 107 generaciones y descartando un burn-in del 25%, y luego se visualizó usando ggtree (v3.2.1)49.

El gen que codifica Hans-LanM, codón optimizado para la expresión en E. coli sin su péptido señal nativo de 23 residuos (consulte la Tabla complementaria 15), se obtuvo de Twist Bioscience y se insertó en pET-29b(+) utilizando los sitios de restricción NdeI/ XhoI. Hans-LanM se sobreexpresó en una escala de 2 l y se purificó usando el protocolo establecido para Mex-LanM50, con una modificación: después del paso final de SEC, la proteína se concentró a 5 ml y se dializó frente a 5 g de Chelex 100 en 500 ml de HEPES 30 mM, KCl 100 mM, glicerol al 5%, pH 8,4, para eliminar CaII y trazas de contaminantes metálicos. Este procedimiento dio como resultado aproximadamente 15 ml de proteína 550 µM, que no se concentró más. El rendimiento final fue de 45 mg de proteína por litro de cultivo. Las concentraciones de proteína se calcularon utilizando un coeficiente de extinción de 11 000 M−1 cm−1, basado en la herramienta ExPASy ProtParam51. Hans-LanM(R100K) se purificó usando el mismo procedimiento, dando 30 mg de proteína por litro de cultivo.

Los espectros de dicroísmo circular de Hans-LanM se recolectaron como se describió anteriormente32, a 15 µM (concentración de monómero) en tampón A tratado con Chelex 100 (acetato 20 mM, KCl 100 mM, pH 5,0), a menos que se indique lo contrario. Las soluciones de metal tamponado se prepararon como se describió anteriormente4,23,25,32. Los detalles adicionales están disponibles en la Información complementaria.

Se prepararon muestras de Hans-LanM de tipo salvaje añadiendo lentamente 3,0 equivalentes de metal (0,5 equivalentes a la vez seguido de mezcla) a 1,0 ml de stock concentrado de Hans-LanM (550 μM). A estas concentraciones de proteína, se observó una ligera precipitación para muestras LRE (por ejemplo, LaIII) mientras que se observó una precipitación significativa para muestras HRE (por ejemplo, DyIII). Las muestras se centrifugaron a 12 000 g durante 2 min para eliminar el precipitado y luego se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel (HiLoad 10/300 Superdex 75 pg, bucle de 1 ml, 0,8 ml min−1) en tampón B (30 mM MOPS, 100 mM KCl , 5% de glicerol, pH 7,0). Se recogieron picos que contenían Hans-LanM (con un volumen de elución de 12,0 a 15,0 ml) para evitar los picos agregados de alto peso molecular, lo que produjo 2,0 ml de Hans-LanM metalizado con un rango de entre 114 μM y 128 μM (1,37–1,53 mg ml−1 ).

Las muestras de Hans-LanM(R100K) no forman especies de alto peso molecular ni precipitan con la adición de metal. Para preparar muestras de esta proteína, una solución de proteína 500 μM se diluyó a 250 μM (3 mg ml−1) en tampón B que contenía 0,75 mM de un RECl3 específico, lo que produjo una solución final de 3 mg ml−1 de proteína, con una concentración de 1 :3 proporción de metal, que fue analizada directamente por SEC-MALS.

Para las condiciones de calcio, las proteínas se diluyeron a 250 μM (3 mg ml−1), se añadió CaCl2 5 mM y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. El tampón utilizado para SEC-MALS fue el mismo que el anterior, excepto que también contenía CaCl2 5 mM.

Los experimentos SEC-MALS se realizaron con un sistema de HPLC Agilent 1260 Infinity II equipado con un muestreador automático y un colector de fracciones, y la columna hidrofílica Wyatt SEC tenía perlas de sílice de 5 µm, un tamaño de poro de 100 Å y dimensiones de 7,8 × 300 mm. Se utilizaron detectores de índice de refracción Wyatt Technology DAWN MALS y Wyatt Optilab para analizar la masa molar de los picos que eluyeron de la columna. El sistema SEC-MALS se equilibró durante 5 h con tampón B. El sistema se calibró con albúmina de suero bovino (monómero PM: 66 kDa) en el mismo tampón y se llevó a cabo la normalización y alineación de los detectores de índice de refracción y MALS. Se inyectó un volumen de 15 µl de cada muestra a un caudal de 0,8 ml min−1 con un tiempo de ejecución del cromatograma de 25 min. Los datos se analizaron utilizando el software ASTRA (Wyatt). Cuando se deseaba un análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS), se realizaba un segundo análisis con 150 µl de proteína (alrededor de 4 mg ml−1) inyectados y se recogían fracciones de 200 µl del pico principal. Los datos de BioSAXS se recopilaron posteriormente por triplicado.

Las constantes de disociación para los dímeros de apo, Hans-LanM unido a LaIII y unido a DyIII se determinaron mediante adiciones dilutivas de una reserva de proteína concentrada, seguidas de calorimetría de titulación isotérmica en un calorímetro de titulación isotérmica Auto Affinity de bajo volumen de TA Instruments. La jeringa contenía proteína 300 μM (apo o 2 equivalentes de DyIII unido) o 150 μM o 540 μM (2 equivalentes de LaIII unido), y la celda contenía 185 μl de un tampón emparejado (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7,0 ). Las valoraciones se llevaron a cabo a 30 °C. Las valoraciones consistieron en una primera inyección de 0,2 μl seguida de 17 inyecciones de 2 μl, a menos que se indique lo contrario, con agitación a 125 rpm y un tiempo de equilibrio de 180 s entre inyecciones. Los datos se ajustaron con NanoAnalyze utilizando el modelo de disociación de dímeros, lo que arrojó la constante de disociación de dímeros (Kdimer), la entalpía de disociación (ΔH) y la entropía de disociación (ΔS). Todos los parámetros se muestran en la Tabla 2 de datos ampliados.

Kdimer se define como la constante de disociación para el equilibrio D \(\rightleftharpoons \) 2M, tal que Kdimer = [M]2/[D], donde [D] es la concentración del dímero y [M] es la concentración del monómero, y la concentración de proteína total [P] (medida utilizando el coeficiente de extinción del monómero) está dada por [P] = [M] + 2[D]. Por lo tanto, Kdímero = 2[M]2/([P] − [M]) o

Esta ecuación se puede usar para estimar las concentraciones de monómero y dímero durante los experimentos SEC-MALS, usando valores de Kdimer calculados a partir de experimentos de calorimetría de titulación isotérmica y [P] de la traza SEC-MALS. Esta ecuación también se puede usar para estimar el dímero K máximo posible para la proteína unida a LaIII, dados los datos de SEC-MALS.

Los datos de SAXS se recopilaron en Hans-LanM complejado con RE, a las concentraciones de proteína proporcionadas en la Tabla complementaria 5 utilizando el equipo y en las condiciones descritas en los Métodos complementarios.

La dispersión frontal I(0) y el radio de giro (Rg) se enumeran en la Tabla complementaria 5 y se calcularon utilizando la aproximación de Guinier, que supone que en ángulos muy pequeños (q < 1,3/Rg) la intensidad se aproxima como I( q) = I(0)exp[−1/3(qRg)2]. En las condiciones de enlace de LaIII, NdIII y DyIII, esto concuerda con el tamaño calculado de 17,9 Å para el dímero cristalográfico. La masa molecular se estimó usando una comparación con los datos SAXS de un estándar de albúmina de suero bovino. Los archivos de datos se analizaron para Guinier Rg, dimensión máxima de partículas (Dmax), ajustes de Guinier, diagramas de Kratky y función de distribución de distancia de par utilizando el software ATSAS52. GNOM, dentro de ATSAS, se utilizó para calcular la función de distribución de distancias por pares P(r), a partir de la cual se determinaron Rg y Dmax. Las envolturas de disolvente se calcularon usando DENSS36. Los perfiles de dispersión teóricos de los modelos construidos se calcularon y ajustaron a los datos de dispersión experimental utilizando CRYSOL53. Se usó OLIGOMER54 para estimar las fracciones de monómero y dímero.

A Hans-LanM (2 ml, 1,16 mM, tampón B), se añadieron lentamente 3,0 equivalentes de LaCl3 o DyCl3, 0,5 equivalentes cada vez con mezcla, para minimizar la precipitación. El precipitado se eliminó por centrifugación a 12.000 g durante 2 min. Se eliminaron todos los agregados solubles y la proteína se intercambió en un tampón que carecía de glicerol (tampón C: MOPS 30 mM, KCl 50 mM, pH 7,0) mediante cromatografía de filtración en gel (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, bucle de 1 ml, 0,75 ml min. −1). Se reunió el pico en el rango de 70 a 85 ml y las fracciones se concentraron hasta aproximadamente 500 μl con una concentración final de aproximadamente 1,3 mM.

Mex-LanM se purificó como se describió anteriormente50 y se intercambió en el tampón C antes de la cristalización. La proteína se cargó con 3,5 equivalentes de NdIII (NdCl3).

Los conjuntos de datos de difracción se recopilaron en la línea de luz ID-G del Equipo de Acceso Colaborativo de Ciencias de la Vida y se procesaron con el paquete HKL200055. En todas las estructuras, la información de fase se obtuvo con phenix.autosol56,57 mediante el método de difracción anómala de longitud de onda única, en el que se utilizaron iones lantánidos identificados con HySS58 como dispersores anómalos. Los modelos iniciales se generaron con phenix.autobuild59 con rondas posteriores de modificación y refinamiento manual en Coot60 y phenix.refine61. En las etapas finales del refinamiento del modelo, se refinaron los parámetros de desplazamiento anisotrópico y las ocupaciones para todos los sitios de lantánidos62. La validación del modelo se realizó con el servidor Molprobity63. Las figuras se prepararon utilizando el paquete de software de gráficos moleculares PyMOL (Schrödinger, LLC).

Los cristales se obtuvieron utilizando el método de difusión de vapor de gota sentada, en el que se mezcló 1 μl de solución de proteína (15 mg ml−1) con 1 μl de citrato trisódico 10 mM, pH 7,0 y PEG al 27 % (p/v). 6000 en una placa de 24 pocillos de Hampton Research (número de catálogo HR1-002) a temperatura ambiente. Cristales delgados en forma de placa aparecieron en 3 días. Los cristales adecuados para la recopilación de datos se montaron en bucles de rayón, se empaparon brevemente en una solución crioprotectora que consistía en la solución del pozo suplementada con etilenglicol al 10 % y se congelaron rápidamente en N2 líquido.

Hans-LanM cargado con LaIII cristalizó en el grupo espacial P21 (β = 90.024 °) con cuatro monómeros en la unidad asimétrica. La cifra inicial de mérito y el coeficiente de correlación bayesiano fueron 0,563 y 0,56, respectivamente64. El modelo final consta de los residuos 24–133 en cada cadena, 12 iones LaIII (3 por cadena en la primera, segunda y tercera mano EF), 4 iones NaI65 (1 por cadena en la cuarta mano EF), 273 moléculas de agua y 2 moléculas de citrato. De los residuos modelados, el 100 % se encuentran en regiones permitidas o preferidas según lo indicado por el análisis estadístico de Ramachandran.

Los cristales se obtuvieron utilizando el método de difusión de vapor de gota sentada, en el que se mezcló 1 μl de solución de proteína (15 mg ml−1) con 1 μl de citrato trisódico 250 μM, pH 7,0 y 27% (p/v) PEG 6000 en una placa de 24 pocillos de Hampton Research a temperatura ambiente. Cristales delgados en forma de placa aparecieron dentro de 1 mes. Los cristales adecuados para la recopilación de datos se montaron en bucles de rayón, se empaparon brevemente en una solución crioprotectora que consistía en la solución del pozo complementada con aceite criogénico de perfluoropoliéter de Hampton Research (número de catálogo HR2-814) y se congelaron rápidamente en N2 líquido.

Hans-LanM cargado con DyIII cristalizó en el grupo espacial P21 (β = 93.567 °) con cuatro monómeros en la unidad asimétrica. La cifra inicial de mérito y el coeficiente de correlación bayesiano fueron 0,748 y 0,58, respectivamente64. El modelo final consta de los residuos 24–133 en cada cadena (excepto la cadena D, para la cual no se pueden modelar los residuos 34–38), 14 iones DyIII (4 en las cadenas A y D, 3 en la segunda, tercera y cuarta manos EF de las cadenas B y C) y 656 moléculas de agua. De los residuos modelados, el 100 % se encuentran en regiones permitidas o preferidas según lo indicado por el análisis estadístico de Ramachandran.

La recopilación de conjuntos de datos anómalos se describe en Métodos complementarios.

Los cristales se obtuvieron utilizando el método de difusión de vapor de gota sentada, en el que se mezcló 1 μl de solución de proteína (35 mg ml−1) con 1 μl de sulfato de amonio 0,1 M, Tris 0,1 M pH 7,5 y 20 % (p/v ) PEG 1500 en una placa de 24 pocillos de Hampton Research a temperatura ambiente. Cristales delgados en forma de placa aparecieron dentro de los 6 meses. Los cristales adecuados para la recopilación de datos se montaron en bucles de rayón, se empaparon brevemente en una solución crioprotectora que consistía en la solución del pozo complementada con aceite criogénico de perfluoropoliéter de Hampton Research y se congelaron rápidamente en N2 líquido.

Mex-LanM cargado con NdIII cristalizó en el grupo espacial P212121 con un monómero en la unidad asimétrica. La cifra inicial de mérito y el coeficiente de correlación bayesiano fueron 0,799 y 0,56, respectivamente64. El modelo final consta de los residuos 29–133, 4 iones NdIII y 171 moléculas de agua. De los residuos modelados, el 100 % se encuentran en regiones permitidas o preferidas según lo indicado por el análisis estadístico de Ramachandran.

Todos los datos de fluorescencia se recopilaron usando un fluorómetro Fluorolog-QM en configuración 75-21-C (Horiba Scientific) equipado con un monocromador doble en el brazo de excitación y un monocromador simple en el brazo de emisión. Se utilizó una lámpara de xenón de 75 W como fuente de luz para las mediciones de estado estable y una lámpara de xenón pulsada para las mediciones de resolución temporal. Se utilizaron cubetas de espectrofluorometría de cuarzo de diez milímetros (Starna Cells, 18F-Q-10-GL14-S) para recopilar datos a 90° en relación con la ruta de excitación.

Las mediciones de la vida útil de la fluorescencia se llevaron a cabo utilizando métodos establecidos26,66. En resumen, se preparó una solución de Hans-LanM con 2 equivalentes de EuIII, totalizando 4,5 ml, en matriz de H2O al 100% (tampón: HEPES 25 mM, KCl 75 mM, pH 7,0). La mitad de esta mezcla inicial de proteínas (2,25 ml) se retuvo para uso futuro y el resto se cambió a D2O mediante liofilización para eliminar H2O y resuspensión en D2O al 99,9 % dos veces. Las soluciones de proteína resultantes (en 100 % de H2O y aproximadamente 99 % de D2O) se mezclaron en proporciones variables para producir contenidos de D2O de 0 %, 25 %, 50 % y 75 %. La concentración de proteína fue de 20 µM. Para cada muestra, se midió la constante de tiempo de disminución de la luminiscencia (τ) (λex = 394 nm, λem = 615 nm) con 5000 disparos en un lapso de tiempo de 2500 μs. τ se determinó usando el software FelixFL Powerfit-10 (Horiba Scientific) usando un solo ajuste exponencial. 1/τ se representó frente a la composición porcentual de D2O y se determinó la pendiente de la línea resultante (m). El valor de q se determinó utilizando la siguiente ecuación de la ref. 67:

donde τ−1H2O y τ−1D2O son las inversas de las constantes de tiempo en 100% H2O y D2O, respectivamente (esta última extrapolada mediante la ecuación de la línea ajustada), en ms–1; y nOH = 0, nNH = 0 y nO–CNH = 1 (resultantes de los residuos de Asn coordinados con metales), sobre la base de las estructuras cristalinas de Hans-LanM. Esta ecuación se simplifica a:

Para los experimentos de competencia de fluorescencia, se preparó una solución de Hans-LanM 20 μM o la variante R100K en tampón A (pH 5,0) con dos equivalentes de metal (40 μM). Los espectros de emisión de fluorescencia se recopilaron con ajustes: λex = 278 nm, λem 300–420 nm, tiempo de integración = 0,5 s, tamaño de paso = 1 nm. Las valoraciones se llevaron a cabo mediante la adición de al menos 0,6 μl de valorante (de soluciones madre concentradas de citrato o malonato 10 mM–1 M, pH 5,0). Los espectros se corrigieron por dilución. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado.

Hans-LanM(R100K)-Cys se expresó y purificó como se describe para Mex-LanM-Cys (ref. 6), con un rendimiento final de 50 mg de proteína por litro de cultivo. Para Hans-LanM-Cys, la proteína se purificó mediante la incorporación de las mismas modificaciones anteriores, menos el paso de diálisis, a nuestra purificación Mex-LanM-Cys descrita anteriormente, excepto que el paso SEC se realizó con un tampón reductor (30 mM MOPS , KCl 100 mM, TCEP 5 mM, pH 7,0) con EDTA 5 mM, y congelada bajo N2 líquido antes de la inmovilización.

La funcionalización con maleimida de perlas de agarosa funcionalizadas con amina se describió previamente6. Consulte la Información complementaria para obtener detalles completos.

La inmovilización de Hans-LanM(R100K) se llevó a cabo usando una reacción de conjugación de tiol-maleimida como se describió anteriormente6. En el caso de Hans-LanM, se combinó una concentración final de proteína de alrededor de 0,4 mM (8 ml) con 1 ml de microesferas de maleimida y la reacción de conjugación se llevó a cabo durante 16 horas a temperatura ambiente. El Hans-LanM no conjugado se eliminó lavando con tampón de acoplamiento, y las microesferas de Hans-LanM se almacenaron en tampón de acoplamiento para pruebas posteriores. Para cuantificar el rendimiento de inmovilización de Hans-LanM, se usó el ensayo de proteína Pierce BCA (ThermoFisher Scientific) para determinar la concentración de LanM en la solución de reacción antes y después de la reacción de conjugación como se describió anteriormente.

Las microesferas inmovilizadas con LanM se lavaron con agua desionizada. Se añadió solución de alimentación (5 ml, REs La-Dy equimolar, total 3 mM, pH 5,0) a microperlas de 1 ml y se incubó durante 2 h. Se recogió el líquido en equilibrio y se determinaron las concentraciones de RE mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente como [M]ad. Luego se usaron 4 ml de HCl 0,1 M para desorber los RE de las microesferas y las concentraciones se midieron mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente como [M]de.

El factor de distribución RE (D) entre la fase LanM y la fase de solución se calculó como:

donde [M]LanM y [M]Liquid son las concentraciones molares de cada ion metálico en la fase LanM y la fase de solución en equilibrio, respectivamente. Para tener en cuenta el líquido libre que se absorbió en las microesferas de agarosa, se aplicó la siguiente corrección: [M]Líquido = [M]ad; [M]LanM = (4 × [M]de – [M]ad)/4.

El factor de separación se define como:

donde DRE1 y DRE2 son los factores de distribución de RE1 y RE2, respectivamente.

Las columnas se llenaron y corrieron, y se analizaron las concentraciones de metales, como se describe en nuestro trabajo anterior6; los detalles están disponibles en los métodos complementarios.

Para los experimentos de separación de pares RE, la pureza y el rendimiento de los iones metálicos se definen como:

donde CRE1 y CRE2 son las concentraciones molares de RE1 y RE2, respectivamente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en la Información Complementaria. Las coordenadas se han depositado en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 8DQ2 (LaIII–Hans-LanM), 8FNR (DyII–Hans-LanM) y 8FNS (NdIII–Mex-LanM). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado financieramente principalmente por la subvención DE-SC0021007 (a JAC) del Departamento de Energía (DOE), así como por la subvención CHE-1945015 (a JAC) de la NSF, que respaldó el trabajo de Hans-LanM y Mex-LanM, respectivamente. AKB reconoce la subvención GM119707 de los Institutos Nacionales de Salud y C.-YL reconoce una beca del Fondo Conmemorativo de Investigación Médica Jane Coffin Childs. DMP, CSK-Y. y ZD reconocen el apoyo financiero del Instituto de Materiales Críticos, un Centro de Innovación Energética financiado por el DOE, Oficina de Eficiencia Energética y Energía Renovable, Oficina de Materiales Avanzados y Tecnologías de Fabricación. Parte de este trabajo fue realizado bajo los auspicios del DOE por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo contrato DEAC52-07NA27344 (LLNL-JRNL-840467). Esta investigación utilizó recursos de Advanced Photon Source, una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE operada por el Laboratorio Nacional de Argonne bajo el número de contrato DE-AC02-06CH11357. El uso del Sector 21 del Equipo de Acceso Colaborativo de Ciencias de la Vida fue apoyado por la Corporación de Desarrollo Económico de Michigan y el Tri-Corredor de Tecnología de Michigan (subvención 085P1000817). NHY reconoce los premios SIG de los Institutos Nacionales de la Salud S10-OD0215145 por la instrumentación de calorimetría de titulación isotérmica, S10-OD028589 por la instrumentación SAXS y S10-OD030490 por el sistema de dispersión de luz dinámica SEC-MALS. Damos las gracias a J. Fecko para la asistencia experimental y Y. Jiao y G. Deblonde para los debates.

Departamento de Química, Universidad Estatal de Pensilvania, University Park, Pensilvania, EE. UU.

Joseph A. Mattocks, Jonathan J. Jung, Chi-Yun Lin, Emily R. Featherston, Timothy A. Hamilton, Amie K. Boal y Joseph A. Cotruvo Jr.

Instituto de Materiales Críticos, Dirección de Ciencias Físicas y de la Vida, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, EE. UU.

Ziye Dong, Christina S. Kang-Yun y Dan M. Park

Institutos Huck de Ciencias de la Vida, Universidad Estatal de Pensilvania, University Park, Pensilvania, EE. UU.

Neela H. Yennawar

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Estatal de Pennsylvania, University Park, PA, EE. UU.

Amie K. Boal

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JAC identificó a Hans-LanM y concibió y dirigió el estudio. JAM purificó Hans-LanM y llevó a cabo la mayoría de los análisis bioquímicos, con la ayuda de TAHJJJ cristalizó las proteínas, y JJJ y C.-YL resolvieron las estructuras con aportes de AKBNHY, llevaron a cabo estudios SAXS y supervisaron la recopilación de algunos datos biofísicos. Mex-LanM purificado con ERF. CSK-Y. realizó análisis bioinformáticos. ZD llevó a cabo experimentos de separación de metales, con aportes de DMPJAM, NHY, AKB y JAC escribieron el artículo con aportes de todos los autores. Todos los autores editaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Dan M. Park, Amie K. Boal o Joseph A. Cotruvo Jr.

JAM, JJJ, C.-YL, ZD, ERF, CSK-Y., DMP, AKB y JAC son los inventores de una solicitud de patente presentada por la Universidad Estatal de Pensilvania basada en este trabajo.

Nature agradece a Scott Banta y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

El grupo Hans incluye LanM de bacterias de los géneros Hansschlegelia, Ancylobacter, Methylopila, Oharaeibacter, Starkeya y Xanthobacter. Aunque estos géneros están restringidos a este grupo, los miembros a nivel de familia se encuentran dispersos por toda la red, incluyendo una Xanthobacteraceae y 42 Methylocystaceae.

Tanto DyIII (hasta 0,3 µM) como CaII (hasta 5,5 mM) inducen un cambio conformacional incompleto similar en la proteína, en relación con el cambio conformacional inducido por NdIII y LaIII. Los datos en el panel derecho de a son una titulación representativa de los 3 conjuntos de datos utilizados para generar el gráfico en el panel izquierdo. Los datos en b y c son valoraciones representativas de los 3 conjuntos de datos utilizados para generar la gráfica en la Fig. 1d. Condiciones: proteína 15 μM, acetato 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 10 mM (para titulaciones de Ca y Nd) o EGTA (para titulaciones de Dy), iones metálicos 0-10 mM. Cada punto de datos en (a, panel izquierdo) es la media ± sd para tres mediciones independientes.

Datos fuente

a, Estructura general de la unidad asimétrica, que consta de dos dímeros de Hans-LanM y dos moléculas de citrato de la solución de cristalización. La estructura de cada monómero del dímero es consistente con la estructura de la solución de RMN de Mex-LanM unido a YIII con manos EF 2 y 3 emparejadas y manos EF 1 y 4 emparejadas5. b–e, Detalles de la coordinación de metales en las cuatro manos EF de LaIII-Hans-LanM. Las esferas de coordinación de los iones LaIII en las manos 1, 2 y 3 de EF están constituidas por la cadena lateral Oδ de N1 (monodentado), las cadenas laterales de carboxilato de D3, D5, E9 y E12 (todas bidentados) y un carbonilo de la columna vertebral de S7 (EF1) o T7 (EF2 y EF3), para un número de coordinación total de 10. Todas las distancias del ligando LaIII son 2,5-2,7 Å. El radio del cristal para LaIII de 10 coordenadas lo da Shannon7 como 1,41 Å;7 dado 1,26 Å como radio de O2- de 6 coordenadas, se estima 2,57 Å para la distancia LaIII-O, de acuerdo con nuestros resultados. El ion metálico en EF4 se modeló como NaI debido a las distancias más cortas entre el metal y el ligando, el número de coordinación más bajo y la presencia de sodio en la solución de cristalización. CaII no se puede descartar por completo ya que estaba presente antes en la purificación de proteínas; sin embargo, la proteína se trató con Chelex al final de la purificación y los datos cristalográficos coincidieron con la asignación de NaI determinada por el servidor CheckMyMetal65. Este ion está coordinado en geometría bipiramidal pentagonal distorsionada por cadenas laterales monodentadas D1, N3 y D5, la cadena lateral bidentada E12, el carbonilo principal de Lys113 y una sola molécula de solvente para un número de coordinación total de 7. Las distancias del ligando de la proteína NaI son 2,3-2,5 Å, con una molécula de disolvente a 2,7 Å. En el caso de Mex-LanM, los datos bioquímicos4,26 y la espectroscopia de RMN5 también han respaldado a EF4 como un sitio de unión deficiente de lantánidos, y se modeló sin un ion metálico en la estructura del estado de solución de RMN5.

a, Uno de los dímeros en la unidad asimétrica, que comprende las cadenas A y B. Tenga en cuenta que EF4 está inesperadamente ocupado con DyIII mientras que EF1 está ocupado solo en la cadena A. b, Estructura general de la unidad asimétrica, que consta de dos Hans-LanM dímeros. A diferencia de la estructura LaIII-Hans-LanM, los dos dímeros, y los monómeros dentro de cada dímero, muestran diferencias significativas en DyIII-Hans-LanM. EF2-4 están ocupados por DyIII en todas las cadenas, mientras que EF1 solo está ocupado y ordenado en la cadena A; en las cadenas B y C, ningún ion metálico está unido a la mano EF, y en la cadena D, un ion DyIII está unido, pero los primeros cinco residuos de EF1 (Asn34 - Asp38) no pudieron modelarse. Nuestra decisión de modelar DyIII en las cuatro manos EF está respaldada por conjuntos de datos de difracción anómalos (Tablas complementarias 9-10, Figuras complementarias 25-26). Los datos bioquímicos sugieren que, en solución, al menos un sitio de unión de DyIII es débil (consulte la Fig. 1d y la Fig. 2 complementaria) y, según los estudios de Mex-LanM, es probable que EF2/3 sean los sitios de unión más estrechos. Esta propuesta está respaldada por los datos anómalos de Dy (Tabla complementaria 10), y la ocupación de sitios débiles de unión a metales probablemente se deba a la alta concentración de proteína utilizada para la cristalografía. c, Detalles de coordinación de metales en las manos EF de DyIII-Hans-LanM. En la fila superior, se muestran las tres estructuras EF1 diferentes en la unidad asimétrica. Solo en la cadena A el sitio metálico EF1 es casi idéntico a los sitios en EF2 y EF3 (al contrario de LaIII-Hans-LanM, donde los sitios EF1-3 son muy similares, datos ampliados, figura 3). En EF1 (cadena A), EF2 y EF3, los ligandos de coordinación son los mismos que con LaIII-Hans-LanM, excepto que los residuos de E9 (Glu42, Glu66 y Glu91) se han desplazado a una coordinación monodentada, lo que da como resultado una coordinación 9 . El número de coordinación más bajo con DyIII es consistente con la contracción de los lantánidos68,69 y se observa con otros ligandos (como un ejemplo reciente, ref. 39). Las distancias del ligando DyIII son en su mayoría de 2,3 a 2,5 Å, ~ 0,2 Å más cortas que para LaIII-Hans-LanM. De acuerdo con esta observación, Shannon7 da el radio del cristal para DyIII de 9 coordenadas como 1,22 Å, 0,19 Å más corto que para LaIII de 10 coordenadas (datos extendidos, figura 3). El cambio de carboxilato del residuo Glu de la novena posición es digno de mención, ya que esta posición es importante para controlar la afinidad y la selectividad en otras proteínas de la mano EF70. En EF4, DyIII tiene 7 coordenadas con geometría bipiramidal pentagonal, similar al sitio de sodio en LaIII-Hans, pero con distancias metal-ligando ligeramente más cortas (2.2-2.5 Å); nuevamente, estas distancias son consistentes con la expectativa para DyIII de 7 coordenadas (ref. 7).

Los valores de emisión se normalizan a 1,0 para la fluorescencia de la apoproteína. Tenga en cuenta que la intensidad de fluorescencia de los residuos de Trp de Hans-LanM disminuye al pasar del estado unido a RE al estado apo (Fig. 30 complementaria), mientras que la intensidad del residuo Tyr de Mex aumenta al pasar del estado unido a RE al estado apo4,6. Condiciones iniciales: proteína 20 μM, RE 40 μM, acetato 20 mM, KCl 100 mM, pH 5,0, para todos los experimentos, en los que se titularon concentraciones crecientes de citrato. Las concentraciones de citrato a las que se desorbe el 50% de cada metal en estas condiciones ([citrato] 1/2) se resumen en la Tabla complementaria 11 y se representan en la Fig. 4a. a, Hans-LanM. b, Hans-LanM(R100K). La diferencia comprimida entre los valores de [citrato]1/2 para La y Nd en Hans-LanM (R100K) frente a Hans-LanM de tipo salvaje ilustra el papel de la dimerización en la mejora de las diferencias de afinidad para los LRE, especialmente LaIII. c, Mex-LanM. Los datos de Nd y Dy se informaron en Dong et al6. d, Comparación de las proporciones del valor de [citrato]1/2 para Nd con respecto a Dy, para cada proteína, que ilustra la mayor selectividad de Nd/Dy de Hans-LanM en relación con Mex-LanM. Las proporciones para Hans-LanM de tipo salvaje y la variante R100K no son significativamente diferentes (p > 0.05) por la prueba t de dos colas, lo que sugiere que la red de enlaces de hidrógeno que involucra a Arg100 contribuye relativamente poco a la selectividad de NdIII/HRE, aunque afecta significativamente la selectividad de LaIII (Fig. 4a). Todos los datos se muestran como media ± sd (a—c) o sem (d) para datos de 3 experimentos independientes.

Datos fuente

El esquema de desorción constaba de tres concentraciones escalonadas de malonato (30, 50, 90 mM; véase el eje de la derecha) seguidas de HCl de pH 1,5. Los resultados revelaron que se generó Dy de una pureza ligeramente inferior con Hans-LanM en comparación con la variante R100K (83,6 % frente a 98 % de pureza de Dy con un rendimiento similar, respectivamente; compárese con la Fig. 4d). Si bien se observaron perfiles de selectividad similares para las proteínas inmovilizadas de La a Gd en experimentos de unión en equilibrio con La-Dy, el patrón de selectividad divergió en Tb (Fig. 4c). La diferencia de selectividad entre Hans-LanM y la variante R100K se confirmó utilizando un sistema binario Nd/Dy, ya que las incertidumbres en la determinación del factor de distribución para Dy en el grupo RE de 9 elementos impidieron la capacidad de distinguir pequeñas diferencias en el Dy/ Factor de separación Nd entre proteínas (Tablas complementarias S13–S14). En este experimento binario Nd/Dy (Tabla 3 de datos ampliados), determinamos un factor de separación de 8,12 ± 0,40 para Hans-LanM y 12,7 ± 1,3 para la variante R100K, lo que es coherente con la eficacia mejorada de separación Dy de R100K. Si bien son consistentes con los valores derivados del experimento de 9 elementos, los resultados difieren ligeramente de los resultados de unión en equilibrio con las proteínas libres Hans-LanM y Hans-LanM (R100K), que revelaron una selectividad similarmente alta para Nd sobre Dy (Fig. 4a ,b), lo que probablemente refleja una dimerización inducida por LRE más débil en la variante R100K a la baja concentración de proteína (20 µM) de los experimentos en solución con proteína libre. La selectividad de La/Nd en la columna también es distinta de la observada con los valores aparentes de Kd de las proteínas libres (de tipo salvaje y R100K) en solución, aunque los experimentos con proteínas libres utilizaron soluciones de un solo elemento y los efectos de la unión de metales mixtos pueden afectar los datos en la columna. La variante R100K también se comporta mejor en la columna, como lo demuestra la estequiometría RE:proteína 2:1. Una posible explicación de estos resultados podría ser que la inmovilización interfiere con la dimerización; sin embargo, la Fig. 2b muestra los extremos N y C del dímero Hans-LanM, lo que indica que los extremos C están a ~20 Å de la parte más cercana de la interfaz del dímero, lo que sugiere que no se espera que la inmovilización per se interrumpa esta interfaz. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que un dímero funcional requeriría que dos terminales C se inmovilizaran muy cerca, lo que es poco probable en las densidades de inmovilización de nuestras columnas. Por lo tanto, en general, sospechamos que el equilibrio de dimerización solo es aplicable en una minoría de unidades de proteína inmovilizadas en la columna. Postulamos que explotar más completamente el equilibrio de dimerización en el formato de columna produciría separaciones aún más robustas. La forma más segura de obtener poblaciones homogéneas de dímeros en la columna probablemente sería unir dos monómeros (p. ej., con una cadena polipeptídica), ajustar la afinidad de dimerización a través de la mutagénesis de los residuos que contribuyen a las interacciones entre monómeros e inmovilizar este dímero a través de una único punto de unión. La dimerización también podría explotarse en otros formatos de separación. Estas direcciones son el tema de los esfuerzos actuales.

Datos fuente

Este archivo contiene métodos complementarios, figuras complementarias 1-31, tablas complementarias 1-16 y referencias complementarias.

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Mattocks, JA, Jung, JJ, Lin, CY. et al. Separación mejorada de tierras raras con un dímero de lanmodulina sensible a los metales. Naturaleza 618, 87–93 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

Descargar cita

Recibido: 29 diciembre 2022

Aceptado: 13 de marzo de 2023

Publicado: 31 mayo 2023

Fecha de emisión: 01 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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