Limosilactobacillus mucosae

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 33 (2023) Citar este artículo

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La enfermedad diarreica causa una alta mortalidad, especialmente en niños y animales jóvenes. El microbioma intestinal está fuertemente asociado con la enfermedad diarreica y algunas cepas específicas de bacterias han demostrado efectos antidiarreicos. Sin embargo, los mecanismos antidiarreicos de las cepas probióticas no han sido dilucidados. Aquí, utilizamos lechones recién nacidos como modelo traslacional y descubrimos que la disbiosis de la microbiota intestinal observada en lechones con diarrea se caracterizaba principalmente por una deficiencia de Lactobacillus, una abundancia de Escherichia coli y una biosíntesis de lipopolisacáridos enriquecida. Limosilactobacillus mucosae y Limosilactobacillus reuteri fueron una bacteria característica que diferenciaba lechones sanos y con diarrea. Los ratones libres de gérmenes (GF) trasplantados con microbiota fecal de lechones con diarrea reprodujeron los síntomas de la enfermedad diarreica. La administración de Limosilactobacillus mucosae, pero no de Limosilactobacillus reuteri, alivió los síntomas de la enfermedad diarreica inducidos por la microbiota fecal de lechones diarreicos y por la exposición a ETEC K88. En particular, las vesículas extracelulares derivadas de Limosilactobacillus mucosae aliviaron los síntomas de la enfermedad diarreica causados ​​por ETEC K88 mediante la regulación de los fenotipos de macrófagos. Los experimentos de eliminación de macrófagos demostraron que las vesículas extracelulares aliviaban los síntomas de la enfermedad diarreica de una manera dependiente de los macrófagos. Nuestros hallazgos brindan información sobre la patogénesis de la enfermedad diarreica desde la perspectiva de la microbiota intestinal y el desarrollo de estrategias terapéuticas antidiarreicas basadas en probióticos.

La enfermedad diarreica es común en los bebés, con más de 500 000 muertes por enfermedad diarreica reportadas cada año en todo el mundo en niños menores de 5 años1,2,3. Además de su alta mortalidad, la enfermedad diarreica en la primera infancia provoca desnutrición y daño intestinal persistente4,5,6. La enfermedad diarreica conduce al deterioro de la función de la barrera intestinal y al aumento de la permeabilidad de la mucosa intestinal, lo que induce la aparición de inflamación intestinal y, en última instancia, el retraso del crecimiento, así como una reducción de la resistencia a las posteriores infecciones por patógenos7,8. Aunque los mecanismos que conducen a la diarrea se han estudiado durante décadas y la mortalidad por diarrea ha disminuido sustancialmente, la diarrea continúa causando una mortalidad y morbilidad significativas en humanos, principalmente debido a sus causas complejas9,10. Por lo tanto, es de gran importancia dilucidar la patogenia de las enfermedades diarreicas neonatales.

La vida temprana es una ventana de oportunidad para el desarrollo de la microbiota intestinal, la función de barrera física intestinal y el sistema inmunitario11. La microbiota intestinal del recién nacido tiene un profundo impacto en la salud del huésped al regular el metabolismo de los nutrientes intestinales, la maduración del sistema inmunitario y el mantenimiento de la barrera intestinal12,13,14,15. La inestabilidad de la microbiota intestinal y la inmadurez del sistema inmunitario hacen que los recién nacidos sean especialmente vulnerables a los patógenos16. Cuando ocurre diarrea, un marcado aumento en la colonización de microorganismos patógenos sigue a la alteración de la composición de la microbiota intestinal, lo que sugiere que las alteraciones de la microbiota aumentan la patogenicidad de estas cepas17. Una microbiota intestinal estable promueve la salud del huésped al mejorar la resistencia a la colonización por microorganismos patógenos18,19.

Recientemente, el trasplante de microbiota fecal (FMT) logró resultados positivos inesperados en el tratamiento de la infección por Clostridium difficile, la enfermedad inflamatoria intestinal y el síndrome del intestino irritable; por lo tanto, el FMT se ha convertido en una terapia de rutina para enfermedades intestinales complejas20,21,22,23. Sin embargo, ha sido un desafío aclarar qué microorganismos intestinales confieren el efecto terapéutico durante el tratamiento de FMT. La creciente evidencia sugiere que la reconstitución de la microbiota intestinal con cepas probióticas clave es una estrategia eficaz contra las enfermedades gastrointestinales24,25. Por lo tanto, la identificación de probióticos específicos potenciales con potencial para aliviar la diarrea puede proporcionar nuevas estrategias para el control preciso de la enfermedad diarreica neonatal y la prevención de enfermedades intestinales.

Las vesículas extracelulares (EV) bacterianas participan en una amplia variedad de funciones fisiopatológicas que implican interacciones intercelulares, como la adquisición de nutrientes, el suministro de factores de virulencia y la regulación inmunitaria26,27. En particular, se ha demostrado que los vehículos eléctricos intervienen en la patogenia y la invasión bacteriana mediante el suministro de toxinas y factores de virulencia a las células huésped28. Gran parte del trabajo inicial sobre los vehículos eléctricos bacterianos se centró en sus funciones en las bacterias gramnegativas patógenas, pero recientemente se ha demostrado que un número cada vez mayor de bacterias grampositivas produce vehículos eléctricos. Por ejemplo, las bacterias Gram-positivas productoras de EV incluyen Bacillus anthracis29, Streptococcus pneumoniae30, B. subtilis31 y C. perfringens32. Lactobacillus es la bacteria Gram-positiva más común, y recientemente se ha descubierto que varias especies de Lactobacillus producen EV, como L. casei BL2333, L. plantarum WCFS134 y L. acidophilus35. Sin embargo, los posibles roles y funciones de estos vehículos eléctricos derivados de Lactobacillus no se han estudiado de forma exhaustiva, aunque un estudio reciente ha demostrado que algunas cepas de Lactobacillus tienen una eficacia superior en la prevención de enfermedades diarreicas en mamíferos24. Por lo tanto, si los Lactobacillus con propiedades antidiarreicas ejercen sus efectos a través de sus vehículos eléctricos merece una mayor exploración.

Las similitudes en la estructura intestinal y el desarrollo entre humanos y cerdos hacen de los cerdos un modelo animal superior para estudiar la base fisiopatológica de las enfermedades gastrointestinales36,37. Aquí, utilizando lechones recién nacidos, ratones libres de gérmenes (GF) y ratones libres de patógenos especificados (SPF) como modelos animales y mediante la integración de multiómica, trasplante microbiano fecal (FMT), Escherichia coli K88 enterotoxigénica (ETEC K88) inducida daño inflamatorio intestinal e intervenciones con Limosilactobacillus mucosae (L. mucosae) y sus vehículos eléctricos derivados, este estudio caracterizó sistemáticamente el microbioma intestinal de lechones recién nacidos con diarrea, reveló además la relación causal entre la microbiota intestinal y los síntomas de la enfermedad diarreica, y elucidó el mecanismo subyacente mediante que Lactobacillus-derivado de lechones sanos reduce los síntomas de la enfermedad diarreica. Estos resultados brindan información sobre cómo los lactobacilos y sus vehículos eléctricos derivados afectan la salud intestinal de los bebés y sugieren estrategias para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la diarrea.

Para revelar las características de la composición y función de la microbiota intestinal en lechones recién nacidos sanos y con diarrea, realizamos la secuenciación metagenómica de muestras fecales recolectadas de 30 lechones recién nacidos sanos y 30 con diarrea (Fig. 1A). A nivel de filo, el índice de riqueza fue significativamente más bajo (P = 0,035), mientras que los índices de Shannon (P = 0,043) y Simpson (P = 0,022) fueron significativamente más altos en lechones con diarrea en comparación con lechones sanos (Figura complementaria 1A). Un análisis de coordenadas principales (PCoA) mostró que la estructura microbiana también difería entre los dos grupos (P = 0.002; Fig. 1B complementaria). Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria fueron el filo dominante en ambos grupos (Fig. 1C complementaria). Las proporciones de Firmicutes y Actinobacteria fueron significativamente más bajas en los lechones con diarrea, mientras que la proporción de Fusobacteria fue significativamente mayor (Fig. 1D complementaria).

Una selección de lechones recién nacidos y diarreicos sanos. B Trasplante de microbiota fecal de lechones sanos y diarreicos a ratones GF. C El efecto protector de L. mucosae y L. reuteri sobre el daño intestinal causado por la microbiota fecal en lechones con diarrea. D El efecto protector de L. mucosae sobre el daño intestinal causado por ETEC K88. E El efecto protector de los EV de L. mucosae sobre el daño intestinal causado por ETEC K88. F Eliminación in vivo de macrófagos en ratones.

A nivel de género, el índice de riqueza fue significativamente más bajo (P = 0,000) y el índice de Simpson (P = 0,018) fue significativamente más alto en lechones recién nacidos con diarrea (Fig. 2A complementaria). También hubo diferencias significativas en la estructura de la microbiota a nivel de género entre los dos grupos (P = 0.000; Fig. 2B complementaria). Lactobacillus, Escherichia y Bacteroides fueron los géneros dominantes en lechones recién nacidos con diarrea, mientras que Lactobacillus, Bacteroides y Prevotella fueron los géneros dominantes en lechones recién nacidos sanos (Fig. 2C complementaria). Identificamos 21 géneros bacterianos diferenciales entre lechones recién nacidos sanos y con diarrea (Fig. 2D complementaria). En comparación con lechones recién nacidos sanos, los lechones recién nacidos con diarrea se caracterizaron por cinco géneros enriquecidos (Vagococcus, Sutterella, Megasphaera, Fusobacterium y Allisonella) y por 16 géneros empobrecidos (Streptococcus, Slackia, Ruthenibacterium, Peptostreptococcus, Lactobacillus, Holdemanella, Gemella, Faecalicoccus, Erysipelatoclostridium , Eisenbergiella, Collinsella, Clostridium, Christensenella, Campylobacter, Anaerotruncus y Anaeromassilibacillus).

A nivel de especie, el índice de Riqueza fue significativamente menor (P = 0,001) en los lechones con diarrea que en los lechones sanos (Fig. 2A). Encontramos diferencias significativas en la estructura microbiana a este nivel entre los dos grupos por análisis de PCoA (P = 0.001; Fig. 2B). Observamos que la abundancia relativa de E. coli fue la más alta en lechones con diarrea, y L. vaginalis fue la más alta en lechones sanos (Fig. 2C). Además, encontramos que las abundancias relativas de un total de 31 especies fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (Fig. 2D). Los análisis de bosques aleatorios mostraron que varias especies clave, incluidas Ruthenibacterium lactatiformans, Limosilactobacillus reuteri (L. reuteri) y L. mucosae, pueden desempeñar un papel importante en la mediación de la aparición de diarrea (Fig. 2E). La precisión del modelo de clasificación aleatoria de bosques establecido utilizando estas 20 bacterias como variables se probó mediante análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC), y se encontró que el valor de AUC alcanzó 0,967, lo que indica la alta precisión de nuestro modelo (Fig. 2F).

Una comparación de la diversidad alfa (Richness, Shannon y Simpson) de los microbiomas intestinales a nivel de especie entre lechones recién nacidos sanos y con diarrea. B PCoA análisis de microbiomas intestinales entre lechones recién nacidos sanos y con diarrea a nivel de especie; los datos se analizaron usando PERMANOVA. C Histograma de la composición de especies de las 20 principales especies bacterianas. D Especies de bacterias diferenciales entre los dos grupos. E Especies clave obtenidas de análisis aleatorios de bosques. Se realizó un análisis F ROC para el modelo de bosque aleatorio. G Las 20 mejores rutas KEGG enriquecidas por KO diferenciales. H Contenido fecal de LPS. n = 30. Los datos se expresaron como la media ± SEM (H) y se realizó ANOVA de una vía, seguido de la prueba de LSD (H). *P < 0,05, grupo con diarrea vs grupo sano.

En total, se identificaron 410 ortólogos (KO) de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) que diferían significativamente entre los dos grupos (Tabla complementaria 1). Un análisis de la función KEGG reveló además que el enriquecimiento de las siguientes vías difería significativamente entre los dos grupos: biosíntesis de cofactores, biosíntesis de aminoácidos, metabolismo del carbono, metabolismo de azúcar amino y azúcar de nucleótido, ribosoma, fosforilación oxidativa, biosíntesis de azúcar de nucleótido de antígeno O , metabolismo de cisteína y metionina, glucólisis/gluconeogénesis, metabolismo de piruvato, ensamblaje flagelar, ciclo de citrato, biosíntesis de aminoacil-tRNA, ruta de pentosa fosfato, recombinación homóloga, reparación de errores de apareamiento, biosíntesis de lipopolisacáridos, metabolismo de tiamina, una reserva de carbono por folato y la célula de Caulobacter ciclo (Fig. 2G). Además, observamos que todos los KO enriquecidos en la ruta de biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS) estaban elevados en lechones recién nacidos con diarrea (Tabla complementaria 1). En consecuencia, el contenido de LPS fecal fue significativamente mayor en los lechones con diarrea en comparación con los lechones sanos (P <0,05; Fig. 2H).

Para evaluar el efecto de la microbiota intestinal de los lechones con diarrea sobre el crecimiento del huésped y el estado inflamatorio, realizamos un experimento FMT (Fig. 1B). Descubrimos que la tasa de aumento del peso corporal del grupo H-FMT fue significativamente mayor que la del grupo D-FMT a partir del día 5, y esta diferencia en las tasas persistió hasta el final del experimento (Fig. 3A). Medimos parámetros bioquímicos de rutina en la sangre (Fig. 3B); recuento total de glóbulos blancos (WBC) (P = 0,001), linfocitos (LYM) (P = 0,049), granulocitos neutrófilos (NEU) (P = 0,041), monocitos (MON) (P = 0,000) y MON% (P = 0,039) fueron significativamente mayores en el grupo D-FMT.

A Pesos corporales de los ratones durante el período experimental. B Niveles de WBC, LYM, NEU, MON, LYM%, NEU% y MON% en la sangre de ratones experimentales. C Gráfica de volcán de genes diferenciales en cinco segmentos intestinales. El azul indica genes que están significativamente regulados a la baja en el grupo D-FMT, y el rojo indica genes que están significativamente regulados al alza en el grupo D-FMT. Vías de señalización de D KEGG enriquecidas en cinco genes diferenciales del segmento intestinal. Los tamaños de los círculos representan el número de genes enriquecidos en la ruta y el color está relacionado con P_adjust. n = 10 para A, B; n = 4 para C, D. Los datos se expresaron como medias ± SEM (A, B) y se realizó ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de LSD (A, B). *P < 0,05: grupo H-FMT frente al grupo D-FMT.

Secuenciamos y analizamos los transcriptomas de las células huésped del duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon de ambos grupos de ratones. Los perfiles de genes en estos cinco segmentos intestinales exhibieron patrones distintos después de FMT (Fig. 3C). Descubrimos que había 134 genes diferenciales en el duodeno, de los cuales 79 genes estaban significativamente regulados al alza y 55 genes estaban significativamente regulados a la baja en el grupo D-FMT. Hubo 309 genes diferenciales en el yeyuno, con 176 genes significativamente regulados al alza y 133 genes significativamente regulados a la baja en el grupo D-FMT. Hubo 1609 genes diferenciales en el íleon, con 670 genes significativamente regulados al alza y 939 genes significativamente regulados a la baja en el grupo D-FMT. Hubo 204 genes diferenciales en el ciego, con 95 genes significativamente regulados al alza y 109 genes significativamente regulados a la baja en el grupo D-FMT. Hubo 812 genes diferenciales en el colon, con 570 genes significativamente regulados al alza y 242 genes significativamente regulados a la baja en el grupo D-FMT.

Anotamos las vías en las que están involucrados estos genes diferenciales (Fig. 3D) y encontramos que varias vías de señalización se enriquecieron significativamente en los cinco segmentos intestinales, incluida la vía de señalización NF-κB, la vía de señalización de la fosfolipasa D, moléculas de adhesión celular, B las vías de señalización del receptor celular, la vía de señalización Fc epsilon RI, la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa/Akt y las vías de señalización del calcio. Además, mostramos que los principales genes diferenciales involucrados en las vías de señalización anteriores se observaron en todos los segmentos intestinales (Fig. 3 complementaria).

Encontramos que la longitud de la vellosidad del íleon en ratones del grupo D-FMT se acortó significativamente (P = 0,000), y la relación entre la longitud de la vellosidad y la cripta en el grupo D-FMT fue significativamente menor (P = 0,000) que la de Grupo H-FMT (Fig. 4A y Fig. 4A complementaria). La puntuación histopatológica del colon fue significativamente mayor en el grupo D-FMT (P = 0,013; Fig. 4A y Fig. 4A complementaria), y el número de mucinas neutras y mucinas ácidas fue significativamente menor en el grupo D-FMT que en el H -Grupo FMT tanto en íleon (P = 0.013/0.009) como en colon (P = 0.043/0.029) (Fig. 4A y Fig. 4A complementaria).

A Secciones de tejido de íleon y colon de ratones H-FMT y D-FMT: la primera fila de la imagen muestra la tinción H&E, la segunda fila muestra la tinción PAS y la tercera fila muestra la tinción AB (barra de escala, 50 μm). B Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el suero. C Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el tejido del íleon. D Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el tejido del colon. E Niveles de proteínas ZO-1, ocludina, AKT y NF-κB y p-AKT y p-NF-κB en íleon y colon. Análisis de F PCoA a nivel de especie: los datos se analizaron utilizando PERMANOVA; Histograma de composición de especies de las 20 especies principales; Las 20 mejores vías KEGG enriquecidas en KO diferenciales; Gráficas de burbujas microbianas de las diferencias entre los grupos H-FMT y D-FMT a nivel de especie. G Análisis PLS-DA del metaboloma; El mapa de calor de los metabolitos diferenciales. El lado izquierdo de la imagen es el grupo enriquecido de metabolitos, y el lado derecho es el nombre del metabolito y su clase correspondiente. n = 10 para A–D, F, G; n = 4 para E. Los datos se expresaron como medias ± SEM (B–D) y se realizó ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de LSD (B–D). *P < 0,05: grupo H-FMT frente al grupo D-FMT.

También medimos los indicadores relacionados con la inflamación y la permeabilidad intestinal en suero, íleon y colon. Los niveles séricos de interleucina (IL)-1β (P = 0,001), IL-6 (P = 0,041), IL-8 (P = 0,017), factor de necrosis tumoral (TNF)-α (P = 0,045), LPS ( P = 0,004), las concentraciones de diamina peroxidasa (DAO) (P = 0,019) y d-lactato (d-LA) (P = 0,021) fueron significativamente más altas en el grupo D-FMT que en el grupo H-FMT (Fig. 4B). Los niveles de IL-1β (P = 0,029), IL-6 (P = 0,013) y TNF-α (P = 0,035) fueron significativamente más altos en el íleon de los ratones del grupo D-FMT que en el H-FMT grupo, pero no hubo una diferencia significativa en los niveles de LPS, IL-8, DAO o D-LA en el íleon de los ratones GF entre los dos grupos (Fig. 4C). Los niveles de IL-1β (P = 0,041), IL-6 (P = 0,005), IL-8 (P = 0,004), TNF-α (P = 0,039) y LPS (P = 0,037) en el colon fueron significativamente más alto en el grupo D-FMT que en el grupo H-FMT, mientras que DAO y d-LA no fueron significativamente diferentes (Fig. 4D) entre los dos grupos. Como se muestra en la Fig. 4E, los niveles de expresión de las proteínas ZO-1 y ocludina en el grupo D-FMT se redujeron significativamente tanto en el íleon como en el colon. Además, la abundancia de proteínas de AKT total y NF-κB fue similar entre los grupos D-FMT y H-FMT, pero los niveles de p-AKT y p-NF-κB en D-FMT fueron significativamente más altos en el grupo D-FMT. que los del grupo H-FMT.

Para investigar la composición y función del microbioma intestinal en ratones GF después de FMT, realizamos análisis de secuenciación metagenómica en muestras fecales. A nivel de filo, hubo una diferencia significativa en el índice de riqueza (P = 0.003; Fig. 5A complementaria). No se observaron diferencias en la diversidad beta a nivel de filo entre los dos grupos (Fig. 5B complementaria). Analizamos la composición del filo de los dos grupos (Fig. 5C complementaria) y descubrimos que la microbiota de ambos grupos estaba compuesta principalmente por Bacteroidetes y Firmicutes. Un análisis adicional de las diferencias en las bacterias mostró que se observó una abundancia relativa significativamente menor de Actinobacteria en el grupo D-FMT (Fig. 5D complementaria).

A nivel de género, el grupo D-FMT tuvo un índice de Shannon (P = 0.015) y un índice de Simpson (P = 0.003) significativamente más bajos que el grupo H-FMT (Fig. 6A complementaria). También encontramos diferencias significativas en la composición bacteriana a nivel de género entre los dos grupos (P = 0.001; Fig. 6B complementaria). Los microbios en ambos grupos estaban compuestos principalmente por Bacteroides y Parabacteroides (Figura 6C complementaria), y un análisis diferencial identificó 24 géneros, incluidos Bacteroides, Parabacteroides, Erysipelatoclostridium y varios otros (Figura 6D complementaria).

A nivel de especie, hubo diferencias significativas en la estructura de la microbiota entre los dos grupos según lo determinado por los análisis de PCoA (P = 0,001; Fig. 4F). Los resultados de la composición microbiana mostraron que Bacteroides eggerthii, B. plebeius y B. thetaiotaomicron eran las especies dominantes en el grupo D-FMT, mientras que B. plebeius, B. thetaiotaomicron y B. intestinalis eran las especies dominantes en el grupo H-FMT (Figura 4F). Se identificaron un total de 44 especies bacterianas que diferían significativamente entre los dos grupos (Fig. 4F). También hubo 873 KO que difirieron significativamente entre los dos grupos (Tabla complementaria 2). Se enriquecieron trece KO en la ruta de biosíntesis de LPS, incluidos 10 KO que se regularon al alza en el grupo D-FMT (Fig. 4F y Tabla complementaria 2).

Evaluamos la similitud de los microbiomas intestinales en ratones y lechones GF (Figura complementaria 7A). Descubrimos que los microbios intestinales en los dos grupos coincidían completamente a nivel de filo. A nivel de género, la tasa de homología alcanzó 82,71% en el grupo sano y 80,67% en el grupo con diarrea. A nivel de especie, la tasa de homología alcanzó 83,61% en el grupo sano y 63,67% en el grupo con diarrea.

También se realizaron análisis de metabolómica fecal en ambos grupos de ratones receptores. La distribución general de los metabolitos y la composición de los metabolitos en los dos grupos se muestran en las Fig. 7B, C complementarias. Hubo diferencias significativas en los metabolitos entre estos dos grupos (Fig. 4G). Un análisis más detallado de los datos reveló que 17 metabolitos diferían entre los dos grupos, con niveles más altos de arginina, propionilcarnitina, ácido picolínico y ácido citracónico en el grupo D-FMT, y ácido 2-butenoico, ácido pentadecanoico, ramnosa, ribulosa, xilulosa , ácido alfa-hidroxiisobutírico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxifenilacético, ácido homovanílico, ácido hidroxifenilláctico, ácido fenilláctico, ácido 3-(3-hidroxifenil)-3-hidroxipropanoico y ácido 3,4-dihidroxihidrocinámico que tienen niveles significativamente más altos en el H -Grupo FMT (Fig. 4G). Los análisis de KEGG revelaron que el metabolismo de la arginina y la prolina, las interconversiones de pentosa y glucuronato y la biosíntesis de aminoacil-tRNA eran las vías en las que se enriquecían los metabolitos (Fig. 7D complementaria).

Aislamos L. reuteri y L. mucosae de muestras fecales de lechones recién nacidos sanos e investigamos el efecto de estos dos lactobacilos específicos sobre los síntomas de la enfermedad diarreica en ratones GF receptores de diarrea (Fig. 1C). Al medir los pesos corporales de los ratones GF a lo largo del tiempo, encontramos que desde el día 5, los ratones GF alimentados con L. mucosae exhibieron una mejora significativa en el retraso del crecimiento causado por la administración de la suspensión de microbiota fecal para diarrea, mientras que la intervención de L. reuteri El grupo no fue significativamente diferente del grupo D-FMT (Fig. 5A).

Se determinaron los pesos corporales de los ratones durante el período experimental. B Secciones de tejido de íleon y colon de ratones experimentales: la primera fila de la imagen muestra la tinción H&E, la segunda fila muestra la tinción PAS y la tercera fila muestra la tinción AB (barra de escala, 50 μm). C Niveles de WBC, LYM, NEU, MON, LYM%, NEU% y MON% en la sangre de ratones experimentales. D Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el suero. E Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el tejido del íleon. F Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el tejido del colon. G Niveles de proteínas ZO-1, ocludina, AKT y NF-κB y p-AKT y p-NF-κB en íleon y colon. H Análisis de coordenadas principales a nivel ASV; Abundancia relativa de la composición bacteriana de la microbiota fecal de ratones GF a nivel de filo y género; Diagrama de burbujas para el análisis diferencial microbiano fecal a nivel de género. n = 10 para A–F y H; n = 3 para G. Los datos se expresaron como medias ± SEM (A y C–F) y se realizó ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de LSD (A y C–F). *P < 0,05.

Mediante la observación histológica del colon y el íleon de los ratones de los tres grupos (Fig. 5B), encontramos que la longitud de las vellosidades (P = 0,004), las mucinas neutras (P = 0,028) y las mucinas ácidas (P = 0,003) del íleon fueron significativamente elevados en el grupo de intervención de L. mucosae en comparación con el grupo de D-FMT (Fig. 4B complementaria). Además, la puntuación histopatológica del colon fue significativamente menor (P = 0,002; Fig. 4B complementaria). Las mucinas neutras (P = 0,010) y las mucinas ácidas (P = 0,003) del colon fueron significativamente más altas en el grupo de intervención de L. mucosae en comparación con el grupo D-FMT (Figura complementaria 4B). Sin embargo, las diferencias en estos indicadores no alcanzaron el nivel de significación estadística al comparar el íleon y el colon en el grupo de intervención de L. reuteri con los del grupo D-FMT (Fig. 4B complementaria).

Los resultados de los índices bioquímicos sanguíneos mostraron que el grupo de intervención de L. mucosae tuvo WBC significativamente más bajos (P = 0,033), LYM (P = 0,022) y LYM% (P = 0,046) en comparación con el grupo D-FMT, mientras que el NEU% ( P = 0,019) fue notablemente mayor en el grupo de intervención de L. mucosae (Fig. 5C). Además, los niveles séricos de IL-1β (P = 0,002), IL-6 (P = 0,007), TNF-α (P = 0,050), LPS (P = 0,003), DAO (P = 0,002) y d- Los LA (P = 0,000) en el grupo de intervención con L. mucosae fueron significativamente más bajos que los del grupo D-FMT (Fig. 5D). También encontramos que los niveles de IL-1β (P = 0,012), IL-6 (P = 0,005), IL-8 (P = 0,004), LPS (P = 0,009), DAO (P = 0,029) y d -LA (P = 0,011) en el íleon del grupo de intervención L. mucosae fueron significativamente más bajos que los del grupo D-FMT (Fig. 5E).

Para el colon, los contenidos de IL-8 (P = 0,000), TNF-α (P = 0,017), LPS (P = 0,036) y D-LA (P = 0,007) fueron significativamente más bajos en la intervención de L. mucosae grupo que en el grupo D-FMT (Fig. 5F). También encontramos que los niveles de expresión de las proteínas ZO-1 y ocludina en el íleon y el colon fueron significativamente más altos en el grupo de intervención de L. mucosae (Fig. 5G). Los niveles de p-AKT y p-NF-κB fueron significativamente más bajos en el grupo de intervención de L. mucosae (Fig. 5G), y estos valores no fueron significativamente diferentes entre el grupo de intervención de L. reuteri y el grupo de D-FMT (Fig. 5G). .5G).

También analizamos los cambios en la estructura y composición de la microbiota intestinal después de la intervención de L. mucosae (Fig. 5H). PCoA mostró que las firmas bacterianas entre los grupos de intervención D-FMT y L. mucosae no eran significativamente distintas en el nivel de variante de secuencia de amplicón (ASV). A nivel de filo, Bacteroidota, Firmicutes y Fusobacteriota fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones de los grupos de intervención D-FMT y L. mucosae. A nivel de género, Bacteroides, Fusobacterium y Bacteroidetes_vadinHA17 fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones D-FMT y los que recibieron la intervención de L. mucosae. Además, identificamos un total de ocho géneros bacterianos discriminatorios entre el grupo D-FMT y el grupo de intervención L. mucosae. En comparación con el grupo D-FMT, el grupo de intervención de L. mucosae se caracterizó por seis especies enriquecidas y dos especies empobrecidas.

También exploramos el efecto de mitigación de L. mucosae sobre los síntomas de la enfermedad diarreica inducidos con ETEC K88 (Fig. 1D). Al medir los pesos corporales de los ratones durante el experimento, encontramos que los ratones alimentados con L. mucosae exhibieron una mejora significativa en el retraso del crecimiento causado por la infección por ETEC K88 (Fig. 6A). Mediante la observación histológica del colon y el íleon de los tres grupos de ratones (Fig. 6B), se encontró que la longitud de las vellosidades (P = 0,005) y la relación entre la longitud de las vellosidades y las criptas (P = 0,024) del íleon estaban significativamente elevadas en el Grupo ETEC K88 + L. mucosae comparado con el grupo ETEC K88 (Fig. 6B). Además, la puntuación histopatológica del colon fue significativamente menor (P = 0,000; Fig. 6B) en el grupo de intervención. Los niveles de suero, íleon y colon de IL-1β (P = 0,004/0,025/0,021), IL-6 (P = 0,022/0,001/0,015), TNF-α (P = 0,002/0,010/0,016), LPS ( P = 0,018/0,001/0,000), DAO (P = 0,003/0,000/0,004) y D-LA (P = 0,003/0,000/0,019) en el grupo ETEC K88 + L. mucosae fueron significativamente menores que los del grupo ETEC Grupo K88 (Fig. 6C-E). Los niveles de expresión de las proteínas ZO-1 y ocludina en íleon y colon fueron significativamente mayores en el grupo ETEC K88 + L. mucosae que en el grupo ETEC K88, mientras que los niveles de p-AKT y p-NF-κB fueron significativamente mayores. inferior (Fig. 6F).

Se determinaron los pesos corporales de los ratones durante el período experimental. Tinción B H&E en secciones de tejido de íleon y colon de ratones experimentales; La longitud de las vellosidades, la longitud de las criptas, la relación entre las vellosidades y la longitud de las criptas del íleon y la puntuación histopatológica del colon (barra de escala, 50 μm). C Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el suero. D Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el tejido del íleon. E Los niveles de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el tejido del colon. F Niveles de proteínas ZO-1, ocludina, AKT y NF-κB y p-AKT y p-NF-κB en íleon y colon. G Análisis de coordenadas principales a nivel ASV; Abundancia relativa de la composición bacteriana de la microbiota fecal de ratones a nivel de filo y género; Diagrama de burbujas para el análisis diferencial microbiano fecal al nivel de ASV. n = 6 para A–E y G; n = 3 para F. Los datos se expresaron como medias ± SEM (A–E) y se realizó ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de LSD (A–E). * P < 0,05.

También analizamos los cambios en la estructura y composición de la microbiota intestinal tras la intervención de L. mucosae (fig. 6G). PCoA mostró que las firmas bacterianas entre los tres grupos no eran significativamente distintas al nivel de ASV. A nivel de filo, Firmicutes, Bacteroidota y Campilobacterota fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones ETEC K88, mientras que Firmicutes, Bacteroidota y Proteobacteria fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones ETEC K88 + L. mucosae. A nivel de género, Lactobacillus, Bacteroidetes_vadinHA17 y Alistipes fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones ETEC K88 y ETEC K88 + L. mucosae. Identificamos un total de dos microbios discriminativos entre los grupos ETEC K88 y ETEC K88 + L. mucosae a nivel de ASV; en comparación con el grupo ETEC K88, el grupo ETEC K88 + L. mucosae se caracterizó por dos bacterias enriquecidas. Las características de la microbiota intestinal en los grupos de control y ETEC K88 + L. mucosae al final de la intervención con L. mucosae pero antes del desafío con ETEC K88 se muestran en la Fig. 8 complementaria.

Exploramos más a fondo el efecto de mitigación de los EV derivados de L. mucosae en los síntomas de la enfermedad diarreica causados ​​por ETEC K88 (Fig. 1E). Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para confirmar la presencia de EV en los cultivos de L. mucosae (Fig. 7A). Los EV de L. mucosae (LmEV) también se cuantificaron mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Fig. 7B). El análisis bioquímico reveló que los LmEV contenían ADN, ARN y proteínas, y el contenido de proteínas era notablemente más alto que el de ADN o ARN (Fig. 9 complementaria). Después de la coincubación con células MODE-K o IPEC-J2 durante 6 h, se encontraron LmEV marcados con DiI (señal roja) en el citoplasma de estas células, lo que sugiere que las células epiteliales intestinales internalizaron los LmEV (Fig. 10 complementaria). Al medir los pesos corporales de los ratones durante el experimento, determinamos que los ratones alimentados con EV derivados de L. mucosae exhibieron una mejora significativa en el retraso del crecimiento causado por la infección por ETEC K88 (Fig. 7C). Tras la observación histológica del colon y el íleon de los tres grupos de ratones (Fig. 7D), se determinó que la puntuación histopatológica del colon era significativamente menor en el grupo de intervención (P = 0,000; Fig. 7D). Además, los niveles de suero, íleon y colon de IL-1β (P = 0,000/0,001/0,000), IL-6 (P = 0,001/0,025/0,000), TNF-α (P = 0,000/0,011/0,004) , LPS (P = 0,001/0,014/0,000), DAO (P = 0,000/0,006/0,003) y d-LA (P = 0,000/0,001/0,000) en el grupo ETEC K88 + LmEV fueron significativamente más bajos que los del grupo Grupo ETEC K88 (Fig. 7E–G). También encontramos que los niveles de expresión de las proteínas Arg1, ZO-1 y ocludina en el íleon y el colon fueron significativamente más altos en el grupo ETEC K88 + LmEVs que en el grupo ETEC K88, mientras que la expresión de iNOS y los niveles de p Las proteínas -AKT y p-NF-κB fueron significativamente más bajas (Fig. 7H).

Un TEM de vehículos eléctricos aislados (barra de escala, 200 o 100 nm). B Distribución del tamaño de los vehículos eléctricos analizados por NTA. C Pesos corporales de los ratones durante el período experimental. Tinción D H&E de secciones de tejido de íleon y colon de ratones experimentales; Mediciones de la longitud de las vellosidades, la longitud de las criptas y las proporciones de longitud de las vellosidades a las criptas del íleon y las puntuaciones histopatológicas del colon (barra de escala, 50 μm). Niveles de IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en E el suero, F el tejido del íleon y G el tejido del colon. H Expresión de proteínas iNOS, Arg1, ZO-1, ocludina, AKT y NF-κB y niveles de p-AKT y p-NF-κB en íleon y colon. I Análisis de coordenadas principales a nivel ASV; Abundancia relativa de la composición bacteriana de la microbiota fecal de ratones a nivel de filo y género; Diagrama de burbujas para el análisis diferencial microbiano fecal a nivel de ASV. n = 3 para A y B; n = 6 para C, E–G e I; n = 5/6 para D; n = 3 para H. Los datos se expresaron como medias ± SEM (C–G) y se realizó ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de LSD (C–G). *P < 0,05.

También analizamos los cambios en la estructura y composición de la microbiota intestinal después de la intervención LmEV (Fig. 7I). PCoA mostró que las firmas bacterianas entre los tres grupos eran significativamente distintas en el nivel de ASV. A nivel de filo, Bacteroidota, Firmicutes y Campilobacterota fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones de los grupos ETEC K88 y ETEC K88 + LmEVs. A nivel de género, Muribaculaceae, Alistipes y Lactobacillus fueron las bacterias predominantes en las heces del grupo ETEC K88, mientras que Muribaculaceae, Lactobacillus y Alistipes fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones ETEC K88 + LmEVs. Además, identificamos un total de 27 bacterias discriminatorias entre los grupos ETEC K88 y ETEC K88 + LmEVs a nivel de ASV; en comparación con el grupo ETEC K88, el grupo ETEC K88 + LmEVs se caracterizó por 13 bacterias enriquecidas y por 14 bacterias empobrecidas.

Para dilucidar las funciones de los macrófagos en la mitigación de los síntomas de la enfermedad diarreica inducida por el desafío ETEC K88 por LmEV, realizamos un experimento de eliminación de macrófagos (Fig. 1F). No se encontraron diferencias en los cambios de peso corporal entre los ratones con eliminación de macrófagos desafiados con ETEC K88 (el grupo ETEC K88-E) y los ratones ETEC K88-E alimentados con LmEV (el grupo ETEC K88 + LmEVs-E) (Fig. 8A). No hubo diferencias significativas en la longitud de las vellosidades yeyunales, la longitud de las criptas, la relación entre las vellosidades y las criptas o las puntuaciones de histopatología del colon entre los grupos ETEC K88 + LmEVs-E y ETEC K88-E (Fig. 8B). Tampoco hubo diferencias obvias en los niveles de suero, íleon y colon de IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO y d-LA entre los grupos ETEC K88 + LmEVs-E y ETEC K88-E ( Fig. 8C–E).

A Pesos corporales de los ratones durante el período experimental. B Tinción H&E de secciones de tejido de íleon y colon de ratones experimentales; Mediciones de la longitud de las vellosidades, la longitud de las criptas y la relación entre la longitud de las vellosidades y las criptas del íleon y las puntuaciones histopatológicas del colon (barra de escala, 50 μm). Los niveles de IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO y D-LA en el suero C, los tejidos del íleon D y los tejidos del colon E. F Análisis de coordenadas principales a nivel ASV; Abundancia relativa de la composición bacteriana de la microbiota fecal de ratones a nivel de filo y género; Diagrama de burbujas para el análisis diferencial microbiano fecal al nivel de ASV. n = 6 para A–F. Los datos se expresaron como medias ± SEM (A–E) y se realizó ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de LSD (A–E). *P < 0,05.

Los cambios en la estructura y composición de la microbiota intestinal después de la intervención de LmEV se muestran en la Fig. 8F. PCoA mostró que las firmas bacterianas entre los tres grupos no eran significativamente distintas al nivel de ASV. A nivel de filo, Firmicutes, Bacteroidota y Proteobacteria fueron las bacterias predominantes en las heces de los ratones ETEC K88-E y ETEC K88 + LmEV-E. A nivel de género, Lactobacillus, Muribaculaceae y Acinetobacter fueron los géneros más dominantes en las heces de los ratones ETEC K88-E, mientras que Lactobacillus, Muribaculaceae y Alistipes fueron los géneros más dominantes en las heces de los ratones ETEC K88 + LmEV-E. Además, identificamos un total de ocho microbios discriminatorios entre los grupos ETEC K88-E y ETEC K88 + LmEVs-E a nivel de ASV. En comparación con el grupo ETEC K88-E, el grupo ETEC K88 + LmEVs-E se caracterizó por cuatro bacterias enriquecidas y cuatro bacterias empobrecidas.

La enfermedad diarreica es un problema de salud mundial para los seres humanos y el ganado38. Se estima que la diarrea ocurre en millones de pacientes, y las enfermedades diarreicas causan miles de millones de dólares en gastos médicos en todo el mundo cada año39. Se supone que la diarrea es causada en parte por la disbiosis de la microbiota intestinal, que actúa como vínculo entre el fenotipo de la enfermedad del huésped y la función fisiológica de los tejidos y órganos24. Por lo tanto, es fundamental dilucidar los mecanismos que subyacen a los trastornos diarreicos, especialmente desde la perspectiva de la microbiota intestinal, para desarrollar nuevas estrategias de prevención y tratamiento. Aquí, primero usamos lechones neonatales sanos y con diarrea como modelos para revelar sistemáticamente las características de los microbiomas intestinales neonatales en estas diferentes condiciones, e identificamos cepas probióticas potenciales específicas que distinguen a los individuos sanos y con diarrea. En segundo lugar, trasplantamos microbiota fecal de lechones recién nacidos sanos y con diarrea a ratones GF para dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales la microbiota intestinal alterada de los recién nacidos con diarrea provoca daño intestinal y retraso del crecimiento. Además, realizamos ensayos de intervención utilizando componentes probióticos específicos aislados de individuos sanos y demostramos una eficacia paliativa superior contra los síntomas de la enfermedad diarreica. Finalmente, demostramos que los EV derivados de probióticos modulan los fenotipos de macrófagos para contrarrestar los síntomas de la enfermedad diarreica.

El uso de lechones recién nacidos como modelo traslacional permitió dilucidar las características de la microbiota intestinal de individuos sanos y diarreicos. Los resultados de nuestro análisis metagenómico mostraron que los lechones recién nacidos con diarrea sufren un trastorno de la microbiota intestinal, que se caracteriza por una estructura de microbiota intestinal distinta de la de los individuos sanos. Lactobacilos spp. actualmente son reconocidos como probióticos que juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de la microbiota intestinal40. Nuestros datos revelaron que Lactobacillus spp. se encuentran en la abundancia relativa más alta en los intestinos de los recién nacidos sanos y con diarrea, pero que Lactobacillus spp. y algunas especies específicas de Lactobacillus son significativamente deficientes en los intestinos de los recién nacidos con diarrea. Además, identificamos a L. reuteri y L. mucosae como microorganismos clave que distinguieron a los recién nacidos sanos de los diarreicos utilizando modelos de bosques aleatorios. E. coli es el principal patógeno entérico responsable de la enfermedad diarreica, y los niños menores de 5 años son susceptibles a la infección por E. coli41. En nuestro estudio, Escherichia fue el segundo género predominante en las heces de lechones recién nacidos con diarrea. Además, aunque no existieron diferencias estadísticas, la abundancia relativa de E. coli en las heces de los lechones con diarrea fue el doble de la de los lechones sanos. LPS es un factor de virulencia clásico producido por E. coli que causa diarrea42,43, y nuestro análisis funcional KEGG reveló que la biosíntesis de LPS fue significativamente mayor en lechones recién nacidos con diarrea que en lechones recién nacidos sanos. Las Fusobacterias son un pequeño grupo de bacterias Gram-negativas, de las cuales las Fusobacterium se encuentran comúnmente en el tracto digestivo de humanos y animales. La principal especie representativa de Fusobacterium es Fusobacterium nucleatum, que ha demostrado estar fuertemente asociada con la inflamación intestinal y el cáncer colorrectal44,45. En nuestro estudio, el nivel de Fusobacteria fue significativamente mayor en el lechón recién nacido con diarrea, lo que sugiere que Fusobacterium puede ser un mediador intermedio de la inflamación intestinal en lechones que padecen diarrea inducida por E. coli. Nuestra investigación favorece la aclaración de los mecanismos potenciales por los cuales los lactobacilos alivian la enfermedad diarreica en lugar de la patogenia de la diarrea, por lo que hemos dejado el estudio de las bacterias patógenas para trabajos futuros. Los presentes resultados sugieren que el desafío de E. coli y la sobreproducción de LPS son factores de riesgo importantes para la diarrea neonatal, mientras que la ausencia de Lactobacillus debilita severamente la resistencia a la invasión patógena de la microbiota intestinal neonatal.

Además de su potencial como terapia para enfermedades complejas, FMT también ha ayudado a revelar el vínculo intrínseco entre los microbios intestinales y los fenotipos de enfermedades del huésped y las funciones fisiológicas de tejidos y órganos46,47,48. En nuestro estudio, el trasplante de microbiota fecal de lechones con diarrea a ratones GF indujo un retraso significativo del crecimiento acompañado de respuestas inflamatorias sistémicas graves. De acuerdo con los resultados en lechones recién nacidos, hubo diferencias significativas en la estructura de la microbiota intestinal entre los ratones GF que recibieron muestras microbianas de lechones sanos y con diarrea. Aunque la gran mayoría de la microbiota intestinal de los ratones receptores se derivó de cerdos donantes, la composición de especies de la microbiota intestinal de los ratones se alteró radicalmente, un fenómeno común a muchos estudios de FMT49,50. Bacteroides juega un papel importante en las interacciones microbiota intestinal-huésped, y estudios previos han demostrado que Bacteroides puede regular la producción de citocinas proinflamatorias51,52. Nuestros datos mostraron que Bacteroides era dominante en la microbiota intestinal de ambos grupos de ratones, y la abundancia relativa de Bacteroides en las heces de los ratones receptores con diarrea fue significativamente mayor que la de los ratones receptores sanos. En particular, algunas vías funcionales relacionadas con la microbiota intestinal se transfirieron de los cerdos donantes a los ratones receptores, como la biosíntesis de LPS. De manera consistente, nuestros resultados mostraron que las concentraciones séricas de LPS fueron significativamente más altas en los ratones receptores con diarrea que en los ratones receptores sanos. Los metabolitos fecales se consideran una lectura funcional de la microbiota intestinal53, y también hubo diferencias significativas entre los metabolitos fecales de los dos grupos de ratones receptores en nuestro estudio. Los resultados de la identificación de metabolitos diferenciales mostraron que algunos metabolitos con potencial antiinflamatorio (ácido 3,4-dihidroxihidrocinámico54, ácido homovanílico55 y ácido feniláctico56) estaban significativamente enriquecidos en ratones receptores sanos, mientras que un metabolito proinflamatorio (ácido picolínico57) se enriqueció en ratones receptores de diarrea. Estos datos implican que la alteración de la microbiota intestinal y sus metabolitos en los recién nacidos diarreicos son responsables del retraso del crecimiento y las respuestas inflamatorias secundarias a la enfermedad diarreica.

Además de conducir a una alta mortalidad infantil, la enfermedad diarreica es un factor importante de displasia intestinal58,59. La displasia intestinal se manifiesta principalmente como un sistema inmunitario de la mucosa intestinal poco desarrollado y una función de barrera intestinal alterada, lo que aumenta la permeabilidad intestinal y la translocación bacteriana, provocando respuestas inflamatorias sistémicas y, en última instancia, provocando un retraso del crecimiento neonatal60. En este estudio, la microbiota intestinal alterada de lechones con diarrea causó efectos profundos en el desarrollo intestinal en ratones GF receptores, principalmente en forma de cambios dramáticos en los perfiles de expresión génica de todos los tejidos del segmento intestinal (duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon). ). El análisis de enriquecimiento KEGG reveló que los genes diferenciales en los cinco segmentos intestinales se asignaban principalmente a las vías de señalización relacionadas con la inflamación y el sistema inmunitario, como las vías de señalización NF-κB y PI3K-AKT. NF-κB y AKT son moléculas proteicas importantes que median las respuestas inflamatorias y se fosforilan para activar sus funciones biológicas61,62. Nuestros resultados mostraron que la fosforilación de NF-κB y AKT está elevada en los intestinos de los ratones receptores de diarrea, con niveles igualmente elevados de citocinas proinflamatorias en los tejidos intestinales. La inmunodeficiencia y las respuestas inflamatorias deterioran la función de la barrera intestinal, alteran la morfología y la estructura intestinales y aumentan la permeabilidad intestinal, lo que conduce a la infiltración de sustancias nocivas como el LPS desde la luz intestinal hacia la circulación sanguínea63,64. Consistentemente, el trasplante de microbiota fecal de lechones con diarrea deterioró severamente las proteínas de unión estrecha intestinal y la morfología intestinal en ratones receptores. Estos hallazgos demuestran que la microbiota intestinal alterada de los recién nacidos con diarrea induce una respuesta inflamatoria local en el intestino a través de la activación de vías de señalización inflamatorias, lo que a su vez conduce a defectos en el desarrollo intestinal.

En la práctica clínica, el TMF se ha utilizado ampliamente en los intentos de curar los trastornos gastrointestinales y ha mostrado cierta eficacia65,66. Un estudio anterior encontró que FMT redujo la gravedad de la enfermedad al aumentar la abundancia relativa de probióticos67. Como se mencionó anteriormente, identificamos a L. reuteri y L. mucosae como microorganismos intestinales clave que distinguen entre neonatos sanos y diarreicos. Para verificar si su reposición podría rescatar el retraso del crecimiento inducido por la microbiota intestinal y el daño intestinal provocado por la diarrea, llevamos a cabo además experimentos de intervención con probióticos. Estudios previos han demostrado que L. reuteri y L. mucosae tienen capacidad antiinflamatoria68,69. En consecuencia, nuestros datos mostraron que L. mucosae pero no L. reuteri anuló efectivamente la respuesta inflamatoria y el daño intestinal al inhibir la síntesis de LPS y la fosforilación de NF-κB y AKT, aliviando así de manera efectiva el retraso del crecimiento causado por la microbiota intestinal provocada por la diarrea y Infección por ETEC K88. Los probióticos normalmente protegen la salud del huésped matando directamente las bacterias patógenas o remodelando la microbiota intestinal para mejorar la resistencia a la colonización por bacterias patógenas18,24,70. En nuestro estudio, la intervención de L. mucosae aumentó significativamente la abundancia fecal de Lactobacillus spp. en ratones. Estos datos sugieren que L. mucosae de individuos sanos juega un papel importante en la resistencia a la diarrea y al daño intestinal mediante la regulación de la microbiota intestinal. Sin embargo, los mecanismos por los cuales L. mucosae regula la homeostasis intestinal del huésped para aliviar la enfermedad diarreica deben dilucidarse más.

La regulación microbiana de las funciones fisiológicas del huésped puede estar mediada por mediadores activos secretados por la microbiota además de interacciones directas con el huésped71,72. Entre los diferentes mediadores derivados de bacterias, se ha demostrado que los vehículos eléctricos desempeñan un papel clave en la diafonía y la señalización intercelulares73. La comunicación entre los probióticos y las células huésped a través de la secreción de EV ha llamado la atención de la comunidad científica. Estudios recientes han demostrado que algunos vehículos eléctricos derivados de probióticos desempeñan funciones similares a las de sus bacterias parentales74,75. En este estudio, aislamos e identificamos con éxito los vehículos eléctricos derivados de L. mucosae. Además, también demostramos que los LmEV ejercían una mayor eficacia que L. mucosae para aliviar los síntomas de la enfermedad diarreica. Un estudio reciente ha demostrado que los vehículos eléctricos derivados de L. reuteri DSM 17938 por sí solos pueden reproducir completamente los efectos de sus bacterias parentales en la motilidad intestinal76. Además, existe evidencia de que los vehículos eléctricos derivados de L. reuteri DSM 17938 y BG-R46 mejoran la función de barrera intestinal al ser absorbidos por las células epiteliales intestinales, lo que reduce la fuga causada por ETEC77. Los macrófagos también pueden absorber los EV de L reuteri BBC3 para modular la respuesta inmunitaria78. Sin embargo, nuestros datos revelaron que L. reuteri no logró aliviar los síntomas de la enfermedad diarreica, por lo que no realizamos experimentos de seguimiento con vehículos eléctricos derivados de L. reuteri. La L. reuteri utilizada en nuestro estudio se aisló de las heces de lechones recién nacidos sanos, lo que difiere de la cepa modelo utilizada en los informes anteriores, y es probable que la variabilidad entre cepas sea una razón importante de los diferentes hallazgos. Un estudio anterior ha demostrado que L reuteri DSM 17938 o sus EV pueden disminuir la duración de la diarrea aguda y la hospitalización por gastroenteritis aguda, pero no parece prevenir la diarrea nosocomial o la diarrea asociada a antibióticos79, lo que indica que incluso los efectos beneficiosos de la misma cepa pueden diferir en diferentes condiciones patológicas.

Los macrófagos, como células centrales que inician y regulan la respuesta inflamatoria, pueden producir una variedad de citocinas, promover la proliferación de células epiteliales intestinales, regular la integridad de la barrera epitelial y desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis intestinal80,81. Dependiendo de las señales convergentes de los estímulos inflamatorios y el entorno celular, las diferentes fases de activación de los macrófagos se describen ampliamente como polarización proinflamatoria M1 y antiinflamatoria M282,83. Estudios recientes han demostrado un efecto regulador de las vías de señalización de NF-κB y AKT sobre fenotipos de macrófagos84,85. Nuestros datos mostraron que la intervención EV activó la polarización de macrófagos M2 e inhibió la polarización de macrófagos de tipo M1, además de suprimir la expresión de proteínas reguladoras inflamatorias (NF-κB y AKT). En particular, los EV perdieron la capacidad de aliviar los síntomas de la enfermedad diarreica en un modelo de ratón con eliminación de macrófagos. Estos hallazgos indicaron que los LmEV combaten la diarrea al modular la respuesta inflamatoria de una manera dependiente de los macrófagos.

En conclusión, los trastornos de la microbiota intestinal en lechones diarreicos se caracterizaron por alteración de la estructura de la microbiota, ausencia de Lactobacillus, exceso de proliferación de E. coli y biosíntesis de LPS. L. mucosae y L. reuteri eran posibles microbios clave que distinguen a los lechones sanos de los que tienen diarrea. La microbiota intestinal impulsada por la diarrea transmitió con éxito fenotipos de enfermedades diarreicas, como retraso del crecimiento, respuestas inflamatorias y daño intestinal a ratones GF. De manera mecánica, la microbiota intestinal desordenada de los recién nacidos con diarrea activó las vías de señalización proinflamatorias a través de LPS, lo que resultó en estructuras morfológicas intestinales alteradas, una función de barrera intestinal debilitada y una mayor permeabilidad intestinal. El exceso de translocación de LPS desde la luz intestinal a la circulación sanguínea indujo una respuesta inflamatoria sistémica, lo que finalmente condujo a un retraso del crecimiento. L. mucosae aislada de las heces de lechones recién nacidos sanos ejerció su efecto antidiarreico superior al reducir la respuesta inflamatoria y el daño intestinal. Los EV derivados de L. mucosae regularon la homeostasis intestinal activando los macrófagos M2 e inhibiendo los macrófagos M1, aliviando así los síntomas de la enfermedad diarreica. En general, al regular la actividad de los macrófagos a través de la liberación de EV, L. mucosae mejoró la enfermedad causada por los microbios intestinales. Los principales hallazgos de nuestro estudio se resumen en la figura 9. Estos hallazgos brindan una estrategia potencial para la prevención del riesgo de diarrea en los recién nacidos.

Diagrama esquemático que resume los hallazgos del presente estudio.

Se seleccionaron aleatoriamente muestras fecales de lechones sanos recién nacidos para el aislamiento de Lactobacillus. Las muestras de heces congeladas (200 mg) se suspendieron en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y se trituraron completamente mediante pipeteo para crear una suspensión bacteriana. Esta suspensión se diluyó con un gradiente de diez veces en PBS estéril, y se esparcieron volúmenes iguales (100 μL) de cada dilución en medio de agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) y se incubaron anaeróbicamente a 37 °C durante 24 h. Se seleccionaron colonias individuales con diferentes morfologías utilizando asas de inoculación de placas producidas con diferentes diluciones, y las bacterias se purificaron trazando en nuevo medio de agar MRS y se incubaron las placas anaeróbicamente a 37 °C durante 24 h. Después de cuatro ciclos de purificación, se transfirieron colonias individuales de placas de agar MRS a 500 μL de caldo MRS, y el líquido se transfirió en condiciones anaeróbicas a 15 mL de caldo MRS y se incubó a 37 °C durante 24 h. Cuando el caldo MRS estaba turbio, se extrajo el ADN de una porción del caldo bacteriano. Los cebadores universales 27 F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) y 1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) se usaron para amplificar el gen 16S rRNA de la cepa única, y el producto de la PCR se secuenció por el método de Sanger. Otra porción de la solución bacteriana se mezcló con un volumen igual de glicerol estéril al 50 % y se almacenó a -80 °C. Las secuencias del gen 16S rRNA se usaron para escanear la base de datos de secuencias de nucleótidos del NCBI para identificar cepas de L. reuteri y L. mucosae.

Los EV se aislaron de sobrenadantes de cultivo de bacterias L. mucosae78,86. Brevemente, los cultivos bacterianos en la etapa logarítmica de crecimiento se centrifugaron a 8000 × g durante 30 min. El sobrenadante se recogió y se centrifugó nuevamente a 20.000 × g durante 45 min. Luego, este sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 μm (Millipore) y el filtrado se centrifugó en un rotor SW 32 Ti (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.) a 120 000 × g durante 2 h a 4 °C. Se descartó el sobrenadante, y el sedimento se resuspendió en PBS, y la suspensión se filtró y volvió a centrifugar a 120.000 × g durante 2 h a 4 °C. Después de la centrifugación, el sedimento se recogió en PBS. La presencia de EV se confirmó con TEM y el rango de diámetros de partículas de los EV se determinó mediante NTA.

El contenido de proteínas de los LmEV se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas BCA de Solarbio (Solarbio, n.° PC0020) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN y el ARN en los LmEV se cuantificaron mediante el uso del kit de ensayo Qubit™ dsDNA HS (YEASEN, n.º 12640ES60) y el kit de ensayo Qubit™ RNA HS (Invitrogen, n.º Q32852) siguiendo las instrucciones del fabricante, respectivamente. Los contenidos de proteína, ADN y ARN se normalizaron utilizando 1 × 109 partículas de vesículas. La cantidad de LmEV utilizada en los siguientes experimentos se basó en el contenido de proteínas.

Las células MODE-K e IPEC-J2 se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 μg/mL en una atmósfera de CO2 al 5 % a 37 °C. El medio de cultivo celular se cambió a solución salina equilibrada de Hank y, después de 15 min de incubación, se añadieron LmEV marcados con DiI (Sigma, n.º 42364) (10 μg/mL) y las células se incubaron durante 6 h. Las células positivas para DiI se analizaron utilizando un microscopio de fluorescencia.

Todos los procedimientos de recolección de muestras y experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Huazhong, Hubei, China. En este estudio, todos los métodos experimentales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad Agrícola de Salud de Huazhong (Número de aprobación HZAUMO-2022-0005).

Los lechones recién nacidos utilizados en este estudio se obtuvieron de Guangxi Yangxiang Co., Ltd. Después del parto, se seleccionaron 30 camadas de lechones, y de cada camada se seleccionaron un lechón con diarrea y un lechón sano. Los lechones con heces líquidas y acuosas durante al menos 2 días consecutivos se clasificaron como lechones con diarrea, mientras que los lechones sin diarrea u otras enfermedades se clasificaron como lechones sanos87. Se recolectaron muestras fecales de lechones recién nacidos (30 lechones con diarrea y 30 lechones sanos), cuyas edades oscilaron entre 8 y 11 días (Tabla complementaria 3). Todos los lechones seleccionados no recibieron antibióticos, probióticos o prebióticos antes de la recolección de muestras. Las muestras de heces recolectadas se dividieron en dos porciones: una se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y la otra se mezcló en una solución estéril de glicerol-PBS (15 % de glicerol) y luego se congeló en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a -80 °C.

Para preparar las soluciones de FMT, se manipularon muestras fecales de lechones con diarrea o de lechones sanos en condiciones anaeróbicas. Las muestras fecales agrupadas se centrifugaron a 100 × g durante 2 min y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 70 μm88.

Veinte ratones GF (Kunming, 4 semanas de edad) se alojaron en un entorno de aislamiento estéril. El alimento y el agua estuvieron disponibles ad libitum. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos H-FMT (n = 10) o D-FMT (n = 10). Al grupo H-FMT se le administró 200 μL de una suspensión de microbiota fecal de lechones sanos por sonda una vez al día por la mañana durante una semana, y al grupo D-FMT se le administró una cantidad equivalente de suspensión de microbiota fecal de lechones con diarrea. Los animales se criaron normalmente en la segunda semana. Los pesos corporales de los ratones tratados se determinaron cada mañana durante todo el período experimental. Las muestras de heces se recolectaron al final del período experimental y las heces recién recolectadas se sumergieron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Las muestras histológicas de duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon se enjuagaron con PBS para eliminar el contenido intestinal y se fijaron en paraformaldehído al 4%. El resto de los tejidos de duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon se recogieron y almacenaron a -80 °C. Se recogió sangre venosa de la esquina interna del ojo. Se recogieron un total de dos tipos de muestras de sangre. Una de las muestras fue sangre entera, la cual fue colectada en tubos de anticoagulación con EDTA de 0.5 mL para pruebas de parámetros hematológicos. La segunda muestra de sangre se dejó reposar durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente y luego se centrifugó durante 10 min a 1000 × g.

Treinta ratones GF (Kunming, 4 semanas de edad) se dividieron en tres grupos: un grupo D-FMT (n = 10), un grupo D-FMT + L. reuteri (n = 10) y un grupo D-FMT + L. grupo de mucosas (n = 10). El alimento y el agua se proporcionaron ad libitum. Al grupo D-FMT se le administró por sonda 100 μL de una suspensión de microbiota fecal derivada de lechones con diarrea y 100 μL de PBS al día durante la primera semana, y luego 200 μL de PBS al día durante la segunda semana. Al grupo D-FMT + L. reuteri y al grupo D-FMT + L. mucosae se les administró por sonda 100 μL de una suspensión de microbiota fecal de lechones con diarrea y 100 μL de suspensión de bacterias L. reuteri o L. mucosae (1010 UFC/mL ), respectivamente, diariamente durante la primera semana y 200 μL de PBS diariamente durante la segunda semana. Los pesos corporales de todos los ratones se determinaron cada mañana. Los procedimientos de recogida de muestras fueron los mismos que los utilizados en el segundo experimento de prueba con animales.

En este experimento se utilizaron un total de 18 ratones SPF (BALB/c, 4 semanas de edad). Los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos: (1) grupo CON (n = 6); (2) grupo ETEC K88 (n = 6); y (3) grupo ETEC K88 + L. mucosae (n = 6). Los ratones de la cepa ETEC K88 (serotipo O149:K91, K88ac) fueron proporcionados amablemente por el Prof. Wang de la Universidad Agrícola de China (Beijing, China). Durante las primeras tres semanas del experimento, los ratones de los grupos CON y ETEC K88 recibieron 200 μL de PBS por día por sonda, y el grupo ETEC K88 + L. mucosae recibió 200 μL de una suspensión de L. mucosae (1010 UFC/ ml) por día. Posteriormente, se inyectaron 200 μL de PBS por vía intraperitoneal en el grupo CON, y 200 μL de ETEC K88 (2 × 108 UFC/mL) por vía intraperitoneal en los grupos ETEC K88 y ETEC K88 + L. mucosae, y se recolectaron muestras 5 días más tarde. Los pesos corporales de todos los ratones se determinaron cada mañana. Los procedimientos de recogida de muestras fueron los mismos que los utilizados en el segundo experimento de prueba con animales.

En este experimento se utilizaron un total de 18 ratones SPF (BALB/c, 4 semanas de edad). Los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos: (1) grupo CON (n = 6); (2) grupo ETEC K88 (n = 6); y (3) grupo ETEC K88 + LmEVs (n = 6). A los ratones del grupo CON se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 μL de PBS, y a los ratones de los grupos ETEC K88 y ETEC K88 + LmEV se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 μL de ETEC K88 (2 × 108 CFU/mL). Durante los siguientes cinco días consecutivos, los ratones de los grupos CON y ETEC K88 recibieron 200 μL de PBS por vía oral al día, y los ratones del grupo ETEC K88 + LmEV recibieron 50 μg de LmEV en 200 μL de PBS por vía oral al día. Las dosis de tratamiento de LmEV se utilizaron de acuerdo con nuestro estudio previo89. Los pesos corporales de todos los ratones se registraron cada mañana. Los procedimientos de recogida de muestras fueron los mismos que los utilizados en el segundo experimento de prueba con animales.

La eliminación de macrófagos se realizó mediante inyección intraperitoneal con liposomas de clodronato (200 μL/ratón) diariamente durante 3 días antes del experimento y luego cada 3 días durante este experimento como se describió previamente en la ref. 90. Todos los demás pasos experimentales y la recolección de muestras fueron consistentes con el quinto ensayo con animales. Este experimento también se dividió en tres grupos: (1) grupo CON-E (n = 6); (2) grupo ETEC K88-E (n = 6); y (3) grupo ETEC K88 + LmEVs-E (n = 6).

El ADN genómico total de las muestras fecales se extrajo con el QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Tübingen, Alemania). La concentración y la calidad del ADN se midieron con un fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies, CA, EE. UU.). Se utilizó ADN de alta calidad (1 μg) como material de entrada para la construcción de bibliotecas. Las bibliotecas de secuenciación se generaron con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ para Illumina (NEB, EE. UU.). La biblioteca se secuenció utilizando una plataforma Illumina HiSeq y se generaron lecturas de extremos emparejados.

Se obtuvieron lecturas de alta calidad para el análisis posterior filtrando adaptadores, lecturas de baja calidad y contaminación de ADN genómico del huésped a partir de datos de secuenciación sin procesar. La anotación taxonómica se realizó con MetaPhlAn3 (versión 3.0.7)91 y se calculó su abundancia relativa, seguido del cálculo de especies diferenciales entre lechones con diarrea y lechones sanos con la ayuda del método Linear discriminant analysis Effect Size (LEfSe), con un criterio de cribado de la puntuación del Análisis Discriminante Lineal (LDA) ≥2 y P < 0,05. Se utilizaron los paquetes R vegan (versión 2.5-7) y ade4 (versión 1.7-18) para calcular la diversidad alfa y realizar análisis de PCoA. La diferencia en la diversidad alfa entre los dos grupos se calculó utilizando la prueba de Wilcox. La importancia de PCoA se calculó mediante el análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) basado en 9999 permutaciones. Las especies con abundancias relativas medias inferiores al 0,1 % se filtraron y las especies restantes se usaron como característica de entrada para el modelo de clasificación de bosques aleatorios con paquetes R para gatos (versión 0.5.1), bosques aleatorios (versión 4.7-1) y splines (versión 4.1.2). La importancia de las especies se clasificó por la disminución media en la precisión del modelo. Las 20 especies principales se seleccionaron como variables en el modelo de bosque aleatorio y sus valores de área bajo la curva (AUC) se calcularon con el paquete R ROCR (versión 1.0-11) para evaluar la precisión del modelo. Además, se empleó humann3 (versión 3.0.0) para realizar la anotación funcional. El KO diferencial significativo se calculó mediante la prueba de Wilcox. Los KO significativamente diferenciales (p_adj <0,01) se enriquecieron frente a las vías KEGG utilizando el paquete R MicrobiomeProfiler (versión 1.1.3).

La región V3-V4 del gen 16 S rRNA se amplificó con cebadores universales y los productos amplificados se agruparon en cantidades equimolares y se secuenciaron en la plataforma Illumina MiSeq para generar lecturas de extremos emparejados de 300 pb. Las lecturas sin procesar sin códigos de barras estaban sujetas a control de calidad mediante el filtrado de lecturas de baja calidad. Las lecturas de alta calidad resultantes se importaron a QIIME2 como entrada. En resumen, las secuencias de alta calidad se eliminaron primero con el algoritmo DADA2 y se sometieron a una clasificación taxonómica con la base de datos SILVA 132. El análisis de datos se realizó en la plataforma online gratuita de Majorbio Cloud Platform (www.majorbio.com). Los resultados microbianos se ajustaron mediante el análisis de la tasa de descubrimiento falso (FDR) (q < 0,05). Se consideró significación estadística a P < 0,05.

Se usó reactivo Trizol (Invitrogen) para extraer el ARN total. El ARN obtenido se midió utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo, EE. UU.). Siguió la preparación y secuenciación de la biblioteca de transcriptomas92. SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) y Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) y Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) controlaron la calidad de las lecturas emparejadas y las recortaron con parámetros predeterminados. Las lecturas limpias obtenidas se compararon con el genoma de referencia de ratones (http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index) por TopHat (versión 2.0.0) para obtener archivos de abundancia de genes. Para obtener genes expresados ​​diferencialmente entre los dos grupos, el paquete R DESeq2 realizó un análisis de expresión diferencial con un umbral de detección de |log2FoldChange| ≥ 1 y padjust < 0,05. Después de eso, se realizó un análisis de enriquecimiento KEGG para genes expresados ​​​​diferencialmente con un valor de P corregido por Bonferroni ≤ 0.05 para descartar vías significativamente enriquecidas. El análisis de la vía KEGG fue realizado por KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do).

Realizamos la detección y el análisis de la metabolómica con Metabo-Profile (Shanghai, China), luego cuantificamos todos los metabolitos objetivo con Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd93.

Se realizaron ensayos de tinción H&E, PAS y AB94,95. Brevemente, los tejidos intestinales fijados con formaldehído al 4% se incluyeron en parafina y se obtuvieron secciones (5 mm de espesor) y se tiñeron con H&E, PAS o AB. Se utilizó el software CaseViewer (versión 220 2.2) para medir la altura de las vellosidades, la profundidad de las criptas y el número de células caliciformes y glicoproteínas y para evaluar la puntuación histopatológica.

El contenido de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, D-LA y DAO en suero, íleon y tejidos de colon de ratones se midió utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con con las instrucciones del fabricante (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China).

Se utilizaron la solución de lisis de proteínas RIPA (Roche, Penz-berg, Alemania) y los kits de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) para extraer y cuantificar las proteínas de los tejidos intestinales, respectivamente. Las proteínas separadas por electroforesis en gel SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio Trace, Pall Co, EE. UU.). Luego, la membrana de nitrocelulosa se sumergió en un tampón de bloqueo durante 2 h y luego se incubó con los anticuerpos primarios correspondientes durante la noche. Las membranas se lavaron con solución salina tamponada con Tris con Tween (TBST) y luego se sumergieron en una dilución de anticuerpo secundario durante 2 h. Finalmente, la expresión de la proteína se registró y analizó utilizando un sistema de imágenes (Bio-Rad, EE. UU.) y un software de cantidad uno (Bio-Rad, EE. UU.), respectivamente. Los siguientes anticuerpos utilizados en los ensayos de Western blot se mostraron de la siguiente manera: anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, cabra anti-conejo (sc-2004; 1:10,000), cabra anti-ratón (sc-2005 ; 1:10 000)), anticuerpo ZO-1 (Abcam, ab221547; 1:1000), anticuerpo ocludina (Abcam, ab216327; 1:1000), anticuerpo fosfo-AKT (Abcam, ab8933; 1:1000), anticuerpo AKT ( Abcam, ab8805; 1:1000), anticuerpo fosfo-NF-κB (Abcam, ab239882; 1:1000), anticuerpo NF-κB (Abcam, ab207297; 1:1000), anticuerpo iNOS (Abcam, ab178945; 1:1000) , anticuerpo Arg1 (Abcam, ab92274; 1:1000), anticuerpo β-actina (Sigma-Aldrich, A5441; 1:1000). Todos los blots o geles derivan de un mismo experimento y que fueron procesados ​​en paralelo. Las transferencias originales se proporcionan en Información complementaria.

La significación estadística se evaluó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de una prueba LSD post hoc para comparaciones por pares (SPSS versión 20.0 para Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Todos los resultados se expresaron como medias ± SEM. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si P < 0,05. El número de réplicas utilizadas para las estadísticas se indica en las leyendas de las figuras.

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo están disponibles en el repositorio del archivo de lectura de secuencias (SRA) del NCBI con los números de acceso PRJNA847006, PRJNA847017 y PRJNA895872.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (32272898 y 31902189), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hubei (2021CFB436 y 2021CFA018), el Programa de Innovación del Conocimiento del Proyecto Wuhan-Shuguang (2022020801020230) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2662020DKQD004). Damos las gracias al Dr. Canfeng Hua, Universidad de Yale, por sus útiles comentarios sobre el manuscrito.

Estos autores contribuyeron por igual: Jingjing Li, Shuaifei Feng, Zhenyu Wang.

Facultad de Ciencias y Tecnología Animal, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, 430070, China

Jingjing Li, Shuaifei Feng, Jinhui He, Zeyue Zhang, Huicong Zou, Zhifeng Wu, Xiangdong Liu, Hong Wei y Shiyu Tao

Laboratorio Estatal Clave de Nutrición Animal, Facultad de Ciencia y Tecnología Animal, Universidad Agrícola de China, No. 2 Yuanmingyuan West Road, Beijing, 100193, China

Zhenyu Wang

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ST, XL y HW diseñaron la investigación. Los experimentos fueron realizados principalmente por JL, SF y ZW, y algunos experimentos se realizaron con la ayuda de ZW, JH y ZZ, SF y HZ analizaron los datos. ST escribió el manuscrito con la ayuda de todos los autores. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito. JL, SF y ZW contribuyeron igualmente a este estudio.

Correspondencia con Xiangdong Liu, Hong Wei o Shiyu Tao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Li, J., Feng, S., Wang, Z. et al. Las vesículas extracelulares derivadas de Limosilactobacillus mucosae modulan el fenotipo de los macrófagos y orquestan la homeostasis intestinal en un modelo de lechones con diarrea. npj Biofilms Microbiomes 9, 33 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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Recibido: 03 enero 2023

Aceptado: 22 de mayo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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