monocitos

Informes científicos volumen 5, Número de artículo: 15857 (2015) Citar este artículo

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La nicotinamida fosforribosiltransferasa (Nampt) cataliza el paso limitante de la velocidad en la ruta de recuperación de la biosíntesis de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y, por lo tanto, regula la actividad desacetilasa de las sirtuinas. Aquí mostramos la regulación acomodativa del NAD+ miocárdico por Nampt extracelular derivado de monocitos (eNampt), que es esencial para la compensación hemodinámica de la sobrecarga de presión. Aunque la expresión intracelular de Nampt (iNampt) disminuyó en corazones con sobrecarga de presión, la concentración de NAD+ miocárdica y la actividad de Sirt1 se mantuvieron. Por el contrario, iNampt se reguló positivamente en el bazo y los monocitos y la proteína eNampt circulante y el mononucleótido de nicotinamida (NMN), un precursor clave de NAD+, aumentaron significativamente. La inhibición farmacológica de Nampt por FK866 o el agotamiento de monocitos/macrófagos por liposomas de clodronato interrumpieron el mecanismo homeostático de los niveles miocárdicos de NAD+ y la actividad de Sirt1 dependiente de NAD+, lo que llevó a la susceptibilidad a la apoptosis de los cardiomiocitos y a la descompensación cardíaca en ratones con sobrecarga de presión. Estos defectos bioquímicos y hemodinámicos fueron prevenidos por la administración sistémica de NMN. Nuestros estudios descubren un papel crucial de eNampt derivado de monocitos en la adaptación del miocardio a la sobrecarga de presión y destacan una posible intervención que controla el NAD+ miocárdico contra la insuficiencia cardíaca.

El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) es un cofactor de la oxidorreductasa para muchas reacciones metabólicas, como la glucólisis, la β-oxidación de ácidos grasos, el ciclo TCA y la fosforilación oxidativa mitocondrial1. NAD+ también funciona como un sustrato esencial para enzimas como poli(ADP-ribosa) polimerasas2 y sirtuinas3. Las sirtuinas son enzimas dependientes de NAD+ que catalizan la desacetilación de histonas y una amplia variedad de proteínas en múltiples compartimentos celulares4 y las sirtuinas de mamíferos (que comprenden Sirt1-Sirt7) actúan como reguladores fundamentales del mantenimiento de la homeostasis energética y la prevención de enfermedades relacionadas con el envejecimiento4. En consecuencia, la regulación estricta de los niveles intracelulares de NAD+ es fundamental para la supervivencia celular y del organismo en condiciones fisiopatológicas. NAD+ se puede sintetizar de novo, pero la mayoría de NAD+ se sintetiza mediante la vía de recuperación a partir de sus precursores ácido nicotínico, nicotinamida (NAM) o NAM ribosa5. En células de mamíferos, la conversión de NAM a mononucleótido de NAM (NMN) por la NAM fosforribosiltransferasa (Nampt) es el paso limitante de la velocidad de esta vía6. Curiosamente, Nampt existe no solo como una forma intracelular (iNampt) sino también como una forma extracelular (eNampt) en un dímero7 enzimáticamente activo y eNampt, anteriormente denominado factor potenciador de colonias de células pre-B o visfatina, es producido y secretado por los adipocitos, células mononucleares, hepatocitos y cardiomiocitos7-9. Una alta concentración de NMN está presente en el plasma de ratón y la producción extracelular de NMN mediada por eNampt regula la biosíntesis intracelular de NAD+ en tejidos metabólicos como el hígado y el tejido adiposo blanco en ratones diabéticos inducidos por una dieta rica en grasas10.

En el corazón, el nivel de expresión de la proteína Nampt estaba regulado a la baja en condiciones patológicas como isquemia, isquemia/reperfusión y sobrecarga de presión11. Sin embargo, existe controversia sobre si Nampt es beneficioso o perjudicial para la fisiopatología cardíaca9,11,12 y aún no está claro cómo iNampt y eNampt regulan la biosíntesis miocárdica de NAD+ en condiciones patológicas. Aquí demostramos que la concentración miocárdica de NAD+ se conserva a pesar de la disminución de la expresión de iNampt en ratones después de la constricción aórtica transversa (TAC). Mecánicamente, eNampt derivado de monocitos contribuye a la preservación de los niveles miocárdicos de NAD+ que son suficientes para la compensación funcional de la sobrecarga de presión. Nuestros estudios brindan información mecanicista sobre la regulación entre tejidos de la homeostasis cardíaca que involucra monocitos derivados de la médula ósea y apuntan hacia una estrategia terapéutica para manipular esta vía para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.

En primer lugar, examinamos el impacto de la biosíntesis de NAD+ dependiente de Nampt en la respuesta al estrés ante una lesión en cardiomiocitos cultivados de ratas recién nacidas. La doxorrubicina (DOX), un fármaco anticancerígeno de antraciclina, tiene cardiotoxicidad a través de múltiples mecanismos, incluido un aumento del estrés oxidativo, el deterioro de las miofibrilares y la desregulación del Ca2+ intracelular13. La estimulación con DOX disminuyó significativamente la concentración de NAD+ y la actividad enzimática de Sirt1 y, por el contrario, aumentó la acetilación de las proteínas nucleares en los cardiomiocitos, lo que se acentuó aún más con el tratamiento concomitante con FK866, un inhibidor selectivo de Nampt14 (Fig. 1a-c). Se ha informado que Sirt1 regula la función mitocondrial y la utilización de energía y protege a los cardiomiocitos de la muerte celular y la degeneración15,16. De manera consistente, la disminución inducida por DOX en la viabilidad celular y en los niveles de expresión de genes relevantes para la función mitocondrial, como Sod2, Ppargc1a, Pparg y mt-Co3, se exageraron aún más con el tratamiento con FK866 (Fig. 1d, e). Por el contrario, el tratamiento de los cardiomiocitos estimulados por DOX con NMN aumentó significativamente la concentración de NAD+, la actividad enzimática de Sirt1, disminuyó la acetilación de las proteínas nucleares y restauró la viabilidad celular y los niveles de expresión de los genes mitocondriales (Fig. 1f-j). Estos resultados sugieren que la biosíntesis de NAD+ dependiente de Nampt protege contra la cardiotoxicidad inducida por DOX en células cultivadas.

Papel protector de la biosíntesis dependiente de Nampt de la activación de NAD+ y Sirt1 contra la toxicidad inducida por DOX en cardiomiocitos neonatales de rata.

(a) Concentraciones de NAD+ en cardiomiocitos tratados con simulación (n = 7), DOX (n = 7) o DOX + FK866 (n = 11). ** P < 0,01. ( b ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en cardiomiocitos tratados con simulación (n = 4), DOX (n = 5) o DOX + FK866 (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01. ( c ) Análisis de inmunotransferencia de lisina acetilada (Ac-K) e histona H3 en la fracción nuclear de cardiomiocitos tratados con simulacro, DOX o DOX + FK866. Las cuantificaciones de Ac-K/histona H3 se muestran como gráficos de barras (n = 8, en cada grupo). ** P < 0,01. ( d ) Viabilidad celular en cardiomiocitos tratados con simulacro, DOX o DOX + FK866 (n = 6, en cada grupo). ** P < 0,01. ( e ) Los niveles de ARNm de genes asociados a mitocondrias en cardiomiocitos tratados con simulación (n = 7), DOX (n = 7) o DOX + FK866 (n = 5). *P < 0,05 frente a simulacro, **P < 0,01 frente a simulacro, #P < 0,05 frente a DOX, ##P < 0,01 frente a DOX. (f) Concentraciones de NAD+ en cardiomiocitos tratados con simulación (n = 4), DOX (n = 3) o DOX + NMN (n = 4). *P < 0,05, **P < 0,01. ( g ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en cardiomiocitos tratados con simulación (n = 4), DOX (n = 5) o DOX + NMN (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01. ( h ) Análisis de inmunotransferencia de Ac-K e histona H3 en cardiomiocitos tratados con simulacro, DOX o DOX + NMN. Las cuantificaciones de Ac-K/histona H3 se muestran como gráficos de barras (n = 8, en cada grupo). *P < 0,05, **P < 0,01. (i) Viabilidad celular en cardiomiocitos tratados con simulación, DOX o DOX + NMN (n = 6, en cada grupo). ** P < 0,01. ( j ) Los niveles de ARNm de genes asociados a mitocondrias en cardiomiocitos tratados con simulación (n = 7), DOX (n = 5) o DOX + NMN (n = 5). **P < 0,01 frente a simulacro, #P < 0,05 frente a DOX, ##P < 0,01 frente a DOX.

A continuación, para examinar la conexión fisiopatológica entre la biosíntesis de NAD+ dependiente de Nampt y la insuficiencia cardíaca, imponemos una sobrecarga de presión en ratones mediante la producción de TAC. En este modelo, pudimos inducir hipertrofia cardíaca adaptativa con función sistólica preservada a las 2 s e insuficiencia cardíaca y desadaptativa a las 8 s después de la operación (Tabla complementaria 1). A las 8 s después de la operación, los niveles de ARNm y proteína de Nampt se redujeron significativamente en los corazones operados con TAC en comparación con los corazones operados de forma simulada (Fig. 2a, b). Pero, sorprendentemente, la actividad enzimática, así como los niveles de ARNm y proteína de Sirt1 y el nivel de acetilación de la proteína de caja de cabeza de horquilla O1 (FoxO1) no cambiaron entre los corazones operados con TAC y los falsos (Fig. 2c-f). A pesar de la disminución en los niveles de proteína iNampt, la concentración de NAD+ se conservó en los corazones operados con TAC, como lo reveló la medición directa usando un sistema de HPLC (Fig. 2g). También encontramos que la concentración de NMN fue significativamente mayor en los corazones operados con TAC que en los corazones operados de forma simulada (Fig. 2h). Estos resultados sugieren que un aumento en el suministro miocárdico de NMN podría compensar una disminución en la síntesis de NMN dependiente de iNampt para lograr la concentración constante de NAD+ en corazones operados con TAC.

Concentración de NAD+ miocárdica compensada y actividad de Sirt1 a pesar de la disminución de la expresión de Nampt en corazones operados con TAC.

( a ) Los niveles de ARNm de Nampt en corazones a las 8 semanas después de la operación TAC o simulada (n = 5). ( b ) Análisis de inmunotransferencia de Nampt en corazones a las 8 semanas después de la operación. Las cuantificaciones de Nampt/GAPDH se muestran como gráficos de barras (n = 5). ( c ) Los niveles de ARNm de Sirt1 en corazones a las 8 semanas después de la operación (n = 5). ( d ) Análisis de inmunotransferencia de Sirt1 en corazones a las 8 semanas después de la operación. Las cuantificaciones de Sirt1/GAPDH se muestran como gráficos de barras (n = 5). ( e ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en corazones a las 8 semanas después de la operación (TAC, n = 5; simulado; n = 8). ( f ) Análisis de inmunotransferencia de FoxO1 acetilado (Ac-FoxO1) y FoxO1 en corazones a las 8 semanas después de la operación. Las cuantificaciones de Ac-FoxO1/FoxO1 se muestran como gráficos de barras (n = 4). ( g ) concentraciones de NAD + (TAC, n = 10; simulado, n = 11) y (H) concentraciones de NMN (TAC, n = 5; simulado, n = 4) en corazones a las 8 s después de la operación. *P < 0,05, **P < 0,01, NS, no significativo.

En ratones operados con TAC, los niveles plasmáticos de proteína eNampt y NMN aumentaron significativamente, en comparación con los ratones operados de forma simulada (Fig. 3a, b), lo que sugiere que el aumento en la biosíntesis dependiente de eNampt de NMN en plasma puede contribuir al aumento en los niveles miocárdicos de NMN en ratones operados con TAC. Además, el tratamiento de cardiomiocitos neonatales de rata con suero de ratón operado con TAC indujo una actividad desacetilasa significativamente mayor de Sirt1 que con suero de ratón operado simuladamente (Fig. 3c), lo que sugiere que el aumento en la biosíntesis dependiente de eNampt de NMN en plasma fue suficiente para la activación de Sirt1 en el miocardio.

Monocitos CD11b+ como posibles fuentes de proteína eNampt aumentada en sangre periférica de ratones operados con TAC.

( a ) Análisis de inmunotransferencia de eNampt en plasma a las 8 w después de la operación TAC (n = 16) o simulada (n = 17). Las cuantificaciones de eNampt se muestran como gráficos de barras. ( b ) Concentraciones de NMN en plasma a las 8 semanas después de la operación (n = 6). ( c ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en cardiomiocitos neonatales de rata tratados con suero de ratones a las 8 semanas después de la operación TAC (n = 10) o simulada (n = 3). ( d ) Los niveles de ARNm de Nampt en células mononucleares aisladas de sangre periférica a las 8 semanas después de la operación TAC (n = 8) o simulada (n = 9). ( e ) Los niveles de ARNm de Nampt en células CD11b - y CD11b + en sangre periférica (n = 3). Los datos se muestran como inducción de pliegues sobre células CD11b. ( f ) Los niveles de ARNm de Nampt en células CD11b + en sangre periférica a las 8 semanas después de la operación TAC (n = 10) o simulada (n = 5). *P < 0,05.

En un intento de buscar las posibles fuentes de aumento de eNampt en plasma, examinamos los niveles de expresión de la proteína Nampt en tejidos de ratón después de la operación TAC o simulada. Entre los tejidos examinados, solo el bazo mostró un aumento significativo en la expresión de Nampt después de la operación TAC (Figura 1 complementaria). También encontramos que los niveles de expresión de ARNm de Nampt aumentaron significativamente en células mononucleares aisladas de sangre periférica de ratones operados con TAC (Fig. 3d). Para determinar qué subpoblación contribuye potencialmente al aumento de la expresión de Nampt en las células mononucleares periféricas, separamos las células de las células mononucleares periféricas de ratones no operados utilizando el marcador de linaje mielomonocítico CD11b (Figura complementaria 2a) y descubrimos que las expresiones de ARNm de Nampt eran significativamente más altas en las células CD11b + que en CD11b - células (Fig. 3e). Además, las expresiones de ARNm de Nampt en células CD11b + de ratones operados con TAC fueron significativamente más altas que las de ratones operados de forma simulada (Fig. 3f). Las células CD11b+ aisladas de células mononucleares periféricas mostraron altos niveles de expresión de ARNm de Emr1 (Figura 2b complementaria) y, por lo tanto, se consideraron monocitos CD11b+, F4/80+. Dado que el bazo es un reservorio de monocitos extramedulares que se movilizan en respuesta a la isquemia miocárdica17, especulamos que los monocitos podrían ser la posible fuente del aumento de la proteína eNampt plasmática.

Para examinar la importancia funcional de Nampt en la compensación hemodinámica de la sobrecarga de presión, administramos FK866 por vía intraperitoneal o simulamos a ratones operados con TAC o simulados. Dado que se observó una disminución en la expresión cardíaca de iNampt y un aumento en la expresión de eNampt en plasma tan pronto como 1 semana después de la operación TAC (Figura 3 complementaria), comenzamos la administración de FK866 el día de la operación. El examen ecocardiográfico reveló que la administración de FK866 durante 1 semana indujo un aumento significativo en la dimensión diastólica final del ventrículo izquierdo (LVEDD) y una disminución significativa en el acortamiento fraccional (FS) en ratones operados con TAC, mientras que estos parámetros no cambiaron en ratones operados de forma simulada. (Cuadro complementario 2). Como consecuencia, aproximadamente el 65 % de los ratones operados con TAC murieron dentro de 1 semana después del tratamiento con FK866 (Fig. 4a). En ratones operados con TAC, el tratamiento con FK866 indujo una disminución significativa en la concentración miocárdica de NAD+ (Fig. 4b) y la actividad desacetilasa de Sirt1 (Fig. 4c) y un aumento en el nivel de acetilación de FoxO1 (Fig. 4d), aunque estos cambios fueron no observado en ratones con operación simulada (Fig. 4b-d). Como consecuencia, la reducción de NAD+ inducida por FK866 condujo a una disminución significativa en los niveles de expresión de genes relevantes para la función mitocondrial, como Tfam, Pparg y Esrra (Fig. 4e) y un aumento significativo en el número de cardiomiocitos positivos para TUNEL ( Fig. 4f,g). Estos resultados sugieren que la inhibición funcional de Nampt interrumpió el mecanismo homeostático de los niveles miocárdicos de NAD+ y la actividad de Sirt1 dependiente de NAD+ y, por lo tanto, indujo la descompensación cardíaca en ratones con sobrecarga de presión.

Descompensación cardiaca por tratamiento con FK866 en ratones sobrecargados de presión.

(a) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones tratados con FK866 (FK) o simulacro después de TAC o operación simulada (simulacro + simulacro, n = 5; simulacro + FK, n = 5; TAC + simulacro, n = 8; TAC + FK, n = 17). (b) Concentraciones de NAD+ en corazones a los 7 días después de la operación (simulado + simulado, n = 3; simulado + FK, n = 3; TAC + simulado, n = 8; TAC + FK, n = 5). ( c ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en corazones a los 7 días después de la operación (simulacro + simulacro, n = 4; simulacro + FK, n = 4; TAC + simulacro, n = 7; TAC + FK, n = 5). (d) Análisis de inmunotransferencia de Ac-FoxO1 y FoxO1 en corazones 7 días después de la operación (simulado + simulado, n = 3; simulado + FK, n = 3; TAC + simulado, n = 7; TAC + FK, n = 5 ). Las cuantificaciones de Ac-FoxO1/FoxO1 se muestran como gráficos de barras. ( e ) Los niveles de ARNm de genes asociados a mitocondrias en corazones a los 7 días después de la operación (TAC + simulacro, n = 12; TAC + FK, n = 6). ( f ) Tinción TUNEL (verde) con tinción nuclear con DAPI (azul) y tinción WGA (rojo) que muestra los contornos de los cardiomiocitos en ratones tratados con FK866 o simulados a los 4 días después de la operación TAC. Barras de escala, 40 μm. ( g ) Cuantificación de cardiomiocitos positivos para TUNEL en corazones a los 4 días después de la operación (TAC + simulacro, n = 6; TAC + FK, n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, NS, no significativo.

Para evaluar más a fondo si la disminución de los niveles miocárdicos de NMN y NAD+ causó una descompensación cardíaca en ratones operados con TAC tratados con FK866, administramos NMN por vía intraperitoneal o simulamos a estos ratones. El tratamiento con NMN mejoró significativamente los parámetros ecocardiográficos como LVEDD y %FS (Tabla complementaria 3) y evitó la muerte prematura en ratones operados con TAC tratados con FK866 (Fig. 5a). El tratamiento con NMN restableció la concentración miocárdica de NAD+ (Fig. 5b), la actividad desacetilasa de Sirt1 (Fig. 5c), el nivel de acetilación de FoxO1 (Fig. 5d), los niveles de expresión de genes relevantes para la función mitocondrial, como Sod2, Ppargc1a, Tfam, Pparg, Esrra y mt-Co3 (Fig. 5e) y el número de cardiomiocitos positivos para TUNEL (Fig. 5f, g). En conjunto, estos resultados sugieren que la biosíntesis de NAD+ dependiente de Nampt es esencial para la actividad desacetilasa de Sirt1 miocárdica y la compensación funcional a la sobrecarga de presión en ratones.

Prevención de la descompensación cardíaca inducida por FK866 mediante la administración de NMN en ratones sobrecargados de presión.

( a ) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones operados con TAC tratados con FK866 (FK) + NMN (n = 9) o FK + simulacro (n = 8). (b) Concentraciones de NAD+ en corazones a los 7 días después de la operación (n = 5). ( c ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en corazones a los 7 días después de la operación (FK + NMN, n = 7; FK + simulacro, n = 6). ( d ) Análisis de inmunotransferencia de Ac-FoxO1 y FoxO1 en corazones a los 7 días después de la operación (FK + NMN, n = 5; FK + simulacro, n = 5). Las cuantificaciones de Ac-FoxO1/FoxO1 se muestran como gráficos de barras. ( e ) Los niveles de ARNm de genes asociados a mitocondrias en corazones a los 7 días después de la operación (n = 4). ( f ) Tinción TUNEL (verde) con tinción nuclear con DAPI (azul) y tinción WGA (rojo) que muestra los contornos de los cardiomiocitos en ratones tratados con FK + NMN o FK + simulacro a los 4 días después de la operación TAC. Barras de escala, 40 μm. ( g ) Cuantificación de cardiomiocitos positivos para TUNEL en corazones a los 4 días después de la operación (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01.

El aumento en la expresión de Nampt en monocitos y la concentración de eNampt en plasma sugirió un vínculo causal entre eNampt derivado de monocitos y la compensación funcional dependiente de Nampt a la sobrecarga de presión. Para probar la importancia de la eNampt derivada de monocitos en este proceso, eliminamos monocitos/macrófagos mediante tratamiento con liposomas de clodronato (CloLip) en ratones18. Confirmamos mediante análisis de citometría de flujo que, en ratones no operados, CloLip indujo una reducción de aproximadamente 3,2 veces en el porcentaje de monocitos CD11b+, F4/80+ circulantes 1 día después del inicio del tratamiento (Fig. 6a, Figura complementaria 4a). El porcentaje de monocitos CD11b+, F4/80+ aumentó aproximadamente 3,1 veces a los 5 días después de la operación TAC, pero disminuyó aproximadamente 1,6 veces con el tratamiento concomitante con CloLip (Fig. 6a, Figura complementaria 4b). Por el contrario, las poblaciones de células CD11b+, F4/80 y células CD11b -, F4/80 no cambiaron significativamente después del tratamiento con CloLip (Figura 4 complementaria). Los ratones tratados con CloLip se volvieron letárgicos y aproximadamente el 75% de los ratones tratados con CloLip murieron dentro de los 5 días posteriores a la operación con TAC, aunque los ratones tratados con liposomas de control (CntrlLip) parecían normales (Fig. 6b). El examen ecocardiográfico reveló un aumento significativo en LVEDD y una disminución significativa en %FS en ratones tratados con CloLip, mientras que estos parámetros no cambiaron en ratones tratados con CntrlLip (Tabla complementaria 4). El tratamiento con CloLip indujo una disminución significativa en la proteína eNampt plasmática (Fig. 6c) sin un cambio significativo en la proteína iNampt cardiaca (Fig. 6d), lo que llevó a una disminución significativa en la concentración de NAD+ (Fig. 6e) y la actividad desacetilasa de Sirt1 (Fig. 6f) y un aumento en el nivel de acetilación de FoxO1 (Fig. 6g). La reducción de NAD+ inducida por CloLip condujo a un aumento significativo en el número de cardiomiocitos positivos para TUNEL (Fig. 6h, i). Estos resultados sugieren que la reducción de células CD11b+ mediada por liposomas de clodronato disminuyó la proteína eNampt plasmática y, por lo tanto, indujo la descompensación cardíaca en ratones sobrecargados de presión.

Descompensación cardiaca por tratamiento con CloLip en ratones sobrecargados de presión.

(a) Análisis de citometría de flujo representativo que demuestra monocitos CD11b+, F4/80+ en sangre periférica de ratones 1 día después del tratamiento con liposomas de clodronato (CloLip) o liposomas de control (CntrlLip) y ratones operados con TAC 5 días después de la operación y el tratamiento con CloLip o CntrlLip. ( b ) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones operados con TAC tratados con CloLip (n = 12) o CntrlLip (n = 8). ( c ) Análisis de inmunotransferencia de eNampt en plasma 5 días después de la operación TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). Las cuantificaciones de eNampt se muestran como gráficos de barras. ( d ) Análisis de inmunotransferencia de iNampt en corazones 5 días después de la operación TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). Las cuantificaciones de Nampt/GAPDH se muestran como gráficos de barras. ( e ) Concentraciones de NAD + en corazones a los 5 días después de la operación TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 7). ( f ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en corazones a los 5 días después de la operación TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). ( g ) Análisis de inmunotransferencia de Ac-FoxO1 y FoxO1 en corazones 5 días después de la operación TAC (CloLip, n = 4; CntrlLip, n = 4). Las cuantificaciones de Ac-FoxO1/FoxO1 se muestran como gráficos de barras. ( h ) Tinción TUNEL (verde) con tinción nuclear con DAPI (azul) y tinción WGA (rojo) que muestra los contornos de los cardiomiocitos en ratones operados con TAC 2 días después de la operación y el tratamiento con liposomas de clodronato (CloLip) o liposomas de control (CntrlLip ). Barras de escala, 40 μm. (i) Cuantificación de cardiomiocitos positivos para TUNEL 2 días después de la operación TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 6). *P < 0,05, **P < 0,01, NS, no significativo.

Además, evaluamos si el tratamiento con NMN previno la descompensación cardíaca inducida por CloLip en ratones sobrecargados de presión. El tratamiento con NMN mejoró significativamente los parámetros ecocardiográficos como LVEDD y %FS (Tabla complementaria 4) y evitó la muerte prematura en ratones operados con TAC tratados con CloLip (Fig. 7a). El tratamiento con NMN restauró la concentración miocárdica de NAD+ (Fig. 7b), la actividad desacetilasa de Sirt1 (Fig. 7c), el nivel de acetilación de FoxO1 (Fig. 7d) y el número de cardiomiocitos positivos para TUNEL (Fig. 7e,f). En conjunto, estos resultados sugieren que eNampt derivado de monocitos es crucial para la síntesis miocárdica de NAD+ suficiente para la compensación funcional de la sobrecarga de presión en ratones.

Prevención de la descompensación cardíaca inducida por CloLip mediante la administración de NMN en ratones sobrecargados de presión.

( a ) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones operados con TAC tratados con CloLip + NMN (n = 12) o CloLip + Mock (n = 24). (b) Concentraciones de NAD+ en corazones 5 días después de la operación TAC (CloLip + NMN, n = 3; CloLip + Mock, n = 5). ( c ) Actividad de desacetilasa de Sirt1 en corazones a los 5 días después de la operación TAC ( n = 4). ( d ) Análisis de inmunotransferencia de Ac-FoxO1 y FoxO1 en corazones a los 5 días después de la operación TAC (n = 4). Las cuantificaciones de Ac-FoxO1/FoxO1 se muestran como gráficos de barras. ( e ) Tinción TUNEL (verde) con tinción nuclear con DAPI (azul) y tinción WGA (rojo) que muestra los contornos de los cardiomiocitos en ratones operados con TAC 2 días después de la operación y el tratamiento con CloLip + NMN o CloLip + simulacro. Barras de escala, 40 μm. ( f ) Cuantificación de cardiomiocitos positivos para TUNEL en los corazones a los 5 días después de la operación TAC (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01.

La compensación del miocardio al aumento de la carga de trabajo se logra a través de procesos complejos e integradores que involucran no solo una serie de vías de señalización intracelular, sino también redes cruzadas de comunicaciones intercelulares y entre tejidos. Nuestro presente estudio demuestra un mecanismo hasta ahora desconocido de regulación entre tejidos de la homeostasis cardíaca por monocitos circulantes. Proporcionamos pruebas de que un aumento en el NMN circulante mediado por la regulación positiva de eNampt derivado de monocitos compensa una disminución en la expresión de iNampt miocárdica para mantener el nivel de NAD+ miocárdico en ratones con sobrecarga de presión (Fig. 8).

Mecanismo homeostático de la biosíntesis dependiente de eNampt derivada de monocitos de NAD+ miocárdico en la compensación cardíaca a la sobrecarga de presión.

(a) La sobrecarga de presión disminuye la expresión cardíaca de iNampt, pero la concentración miocárdica de NAD+ y la actividad de la desacetilasa Sirt1 no cambian. La regulación positiva de eNampt derivada de monocitos contribuye a la preservación de los niveles miocárdicos de NAD+ y a la compensación funcional de la sobrecarga de presión. (b) La inhibición farmacológica de Nampt por FK866 o el agotamiento de monocitos por CloLip suprime la regulación ascendente compensatoria de eNampt derivado de monocitos y interrumpe el mecanismo homeostático de los niveles miocárdicos de NAD+ y la actividad de Sirt1, lo que lleva a una descompensación cardíaca inducida por sobrecarga de presión. (c) La administración sistémica de NMN restaura los niveles miocárdicos de NAD+ y la actividad de Sirt1 y previene la descompensación cardíaca a sobrecarga de presión inducida por FK866 o CloLip.

Se ha informado que la regulación a la baja de Nampt aumentó la muerte celular apoptótica en cardiomiocitos de rata neonatal cultivados11 y también observamos que la biosíntesis de NAD+ dependiente de Nampt protegía contra la cardiotoxicidad inducida por DOX. La sobreexpresión cardíaca específica de Nampt o la administración de NMN aumentó los niveles miocárdicos de NAD+ y protegió al corazón de la isquemia o de la lesión por isquemia/reperfusión en ratones, lo que indica que Nampt es crucial para la síntesis miocárdica de NAD+ y la cardioprotección en corazones estresados11,12. Por otro lado, Pillai et al. informaron que la sobreexpresión cardíaca específica de Nampt indujo hipertrofia cardíaca y fibrosis intersticial espontáneamente en ratones y que la desactivación heterocigota de Nampt atenuó la hipertrofia cardíaca inducida por isoproterenol y angiotensina II, lo que indica que Nampt es un regulador positivo de la remodelación cardíaca adversa9. Teniendo en cuenta los niveles de expresión mucho mayores de Nampt miocárdico en ratones informados por Pillai et al., la producción excesiva de Nampt podría ser perjudicial para la fisiopatología cardíaca. Nuestros datos actuales mejoran claramente nuestra comprensión del papel hasta ahora controvertido de Nampt en la respuesta de estrés a la sobrecarga hemodinámica, lo que demuestra que la inhibición de la descompensación cardíaca inducida por Nampt en la fase temprana de la sobrecarga de presión.

Recientemente, se ha informado que eNampt, al igual que las citocinas y los factores de crecimiento, actúa directamente sobre las células, pero las acciones de eNampt sobre los cardiomiocitos son enigmáticas. El tratamiento con eNampt atenuó la apoptosis inducida por H2O2 en cardiomiocitos H9c219 y la administración intravenosa de eNampt en el momento de la reperfusión redujo el tamaño del infarto de miocardio en un modelo de ratón de isquemia/reperfusión20. Por el contrario, Montecucco et al. informaron que la inhibición farmacológica de Nampt redujo la lesión miocárdica mediada por neutrófilos en la fase temprana de la reperfusión21. No quedó claro si eNampt derivado de monocitos tiene efectos biológicos en los cardiomiocitos, pero encontramos que el NMN plasmático aumentó significativamente en ratones operados con TAC y que el tratamiento de cardiomiocitos neonatales de rata con suero de ratón operado con TAC indujo una actividad desacetilasa significativamente mayor de Sirt1. Por lo tanto, NMN podría convertirse extracelularmente de NAM por eNampt a nivel sistémico y usarse como sustrato para la biosíntesis de NAD+ después de transportar el flujo a las células a través de un transportador de NMN no identificado en los corazones. Se requerirán más estudios que utilicen modelos genéticos elaborados para eliminar Nampt específicamente en cardiomiocitos o monocitos para diseccionar la regulación cooperativa de NAD+ miocárdico por iNampt y eNampt en los corazones sometidos a sobrecarga de presión e isquemia/reperfusión.

La biosíntesis de NAD+ dependiente de nampt es un determinante clave de la actividad desacetilasa de las sirtuinas6. Nuestro análisis de la actividad de la desacetilasa de Sirt1 reveló que invariablemente se correlacionó con la concentración miocárdica de NAD+ tanto in vitro como in vivo. En un modelo de ratón de isquemia/reperfusión, la sobreexpresión cardíaca específica de Sirt1 redujo el tamaño del infarto a través de la activación de FoxO1 y la superóxido dismutasa de manganeso, mientras que la desactivación cardíaca específica de Sirt1 exacerbó la lesión miocárdica22. Sin embargo, se observaron fenotipos contradictorios atribuibles a las dosis génicas del transgén en el desarrollo de hipertrofia cardíaca en ratones con sobreexpresión cardíaca de Sirt1. Los niveles bajos a moderados de sobreexpresión de Sirt1 atenuaron la progresión dependiente del envejecimiento de la remodelación y la disfunción cardíaca, pero los niveles altos de sobreexpresión de Sirt1 aumentaron el estrés oxidativo y la apoptosis, lo que condujo a la disfunción cardíaca23,24. Los efectos beneficiosos de Sirt1 están mediados por una combinación de múltiples mecanismos, como la desacetilación del coactivador 1α del receptor γ activado por el proliferador de peroxisomas para modular la función mitocondrial16,25, la regulación positiva de la superóxido dismutasa de manganeso para eliminar ROS22,26, la desacetilación de p53 para inhibiendo la muerte celular apoptótica27 y la desacetilación de FoxO1 para inducir la autofagia28. Por el contrario, Oka et al. informaron que Sirt1 sobreexpresado, al formar un complejo con el receptor-α activado por el proliferador de peroxisomas, suprimió las vías de los receptores relacionados con el estrógeno, lo que condujo a la disfunción mitocondrial y la progresión de la insuficiencia cardíaca29. En ratones operados con TAC, los niveles de expresión de genes relevantes para la función mitocondrial se correlacionaron con la actividad de la desacetilasa de Sirt1, ya sea cuando disminuyó con el tratamiento con FK866 o cuando se restableció con el tratamiento con NMN, lo que respalda la posibilidad de que la biosíntesis dependiente de Nampt de El NAD+ miocárdico está implicado en la regulación de la función mitocondrial. Dado que se ha informado que Sirt3 y Sirt7, así como Sirt1, tienen funciones beneficiosas en el corazón15, se requerirán más estudios para comprender el panorama completo de los mecanismos compensatorios facilitados por la biosíntesis dependiente de eNampt de NAD+ y la activación dependiente de NAD+ de Sirt1 y otros sirtuinas en corazones sobrecargados de presión.

En el cerebro y el páncreas, los niveles de expresión basal de iNampt son extremadamente bajos y el NMN circulante mantenido por las funciones de eNampt en plasma es un sustrato esencial para la biosíntesis de NAD+ intracelular7. Estudios recientes han demostrado la efectividad de la suplementación con NMN para la restauración de NAD+ en estos tejidos7,10,30,31. En las condiciones patológicas en las que disminuyen los niveles de NMN circulantes, la suplementación con NMN puede proporcionar un beneficio terapéutico. Se ha informado que los niveles de proteína Nampt y NAD+ disminuyen con el envejecimiento en múltiples tejidos10,32. Observamos que los ratones envejecidos mostraron una disminución significativa en los niveles de NAD+ miocárdico y proteína eNampt plasmática, en comparación con ratones jóvenes, aunque los niveles de proteína iNampt miocárdica no cambiaron (Figura complementaria S5). Es bien sabido que la prevalencia de insuficiencia cardiaca aumenta con la edad y que los ancianos con insuficiencia cardiaca tienen peor pronóstico que los más jóvenes33. Tiene sentido plantear la hipótesis de que la disminución dependiente de la edad en el suministro de NMN mediado por eNampt podría causar una disminución en el NAD+ miocárdico, lo que lleva a una mayor susceptibilidad a la insuficiencia cardíaca con mayor morbilidad y mortalidad en los ancianos. Además, un estudio reciente demostró que los niveles altos de eNampt en plasma se asocian con un resultado clínico favorable en pacientes con miocardiopatía dilatada34 y nuestro estudio puede proporcionar una probable explicación mecánica de la correlación entre eNampt en plasma y los fenotipos de insuficiencia cardíaca. Nuestro estudio destacó un mecanismo novedoso de regulación mediada por eNampt circulante de NAD+ miocárdico en condiciones de estrés y abrió una oportunidad para explorar si la restauración de NAD+ miocárdico tiene un potencial terapéutico para la insuficiencia cardíaca.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Osaka y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de la Universidad de Osaka. Se compraron ratones C57BL/6J de CLEA Japan, Inc. Para la operación TAC, anestesiamos ratones macho de 8 a 9 semanas de edad mediante inyección intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) y butorfanol ( 5 mg/kg)35 y la anestesia se controlaba mediante pinzamiento del dedo del pie. La respiración se controló artificialmente con un volumen tidal de 0,2 ml y una frecuencia respiratoria de 110 respiraciones/min. Después de la esternotomía mediana, la aorta transversa entre las ramas de las arterias carótida común izquierda y braquiocefálica derecha se constriñó con hilos de seda 7-0 al ligar la aorta con una aguja de calibre 27 sin punta, que se retiró después de la ligadura. Luego se cerró el tórax y se permitió que los ratones se recuperaran de la anestesia mientras su temperatura corporal se mantenía a 37 °C. Se administró analgesia postoperatoria (meloxicam, 5 mg/kg/24 h) por vía subcutánea durante 48 h. El cirujano no tenía información sobre los ratones utilizados en este estudio. Para inhibir la biosíntesis dependiente de Nampt de NAD+ in vivo, administramos FK866 (10 mg/kg/d) o simulado (aceite de maíz) mediante inyección intraperitoneal a ratones durante la duración del experimento36. Para el tratamiento con NMN, administramos NMN (500 mg/kg) o simulada (solución salina normal) mediante inyección intraperitoneal dos veces al día durante la duración del experimento10,30. Clodronato y liposomas de control (Clophosome, Combo Kit) se adquirieron de FormuMax Scientific, Inc. Para inducir el agotamiento de monocitos y macrófagos, se administró por vía intraperitoneal una dosis de 25 µl de clodronato o liposomas de control. Para la evaluación de las dimensiones y la contractilidad cardíacas, se realizó una ecocardiografía transtorácica en ratones conscientes con un sistema de imágenes Vevo 770 utilizando una sonda lineal de 25 MHz (Visual Sonics Inc.). Los ratones se sacrificaron para recolectar muestras de tejido después de 24 horas de inanición.

Los experimentos para cultivos primarios de cardiomiocitos fueron aprobados por el Comité de Estudio Animal de la Universidad de Osaka y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de la Universidad de Osaka. Brevemente, la eutanasia por dislocación cervical fue realizada por personal capacitado antes de recolectar el tejido cardíaco de ratas Wistar de 1 día de edad de acuerdo con las pautas de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense para la eutanasia de animales. Los ventrículos se trituraron y digirieron en solución salina equilibrada de Hank libre de Ca2+ (HBSS) (Hyclone) que contenía 0,1% de tripsina (Hyclone) y 70 u/ml de colagenasa (Worthington Biochemical Corp.). Los cardiomiocitos se enriquecieron después de la preplaca, se sembraron a una densidad de campo de 1 × 105 células/cm2 y se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino (BGS) al 10 % durante 24 h. Después de la privación de suero (BGS al 1 %) durante 24 h, los cardiomiocitos se estimularon con DOX (1 μM durante 3 h) y el inhibidor alostérico de Nampt FK866 (500 nM durante 24 h) o NMN (500 μM durante 24 h)10. DOX se adquirió de Sigma-Aldrich y FK866 y NMN se adquirieron de Cayman Chemical y Sigma-Aldrich, respectivamente. La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega) que se basa en la conversión metabólica de un compuesto de tetrazolio MTS en un producto coloreado por células vivas.

Las células se lisaron y los tejidos se homogeneizaron en tampón (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0, Na3VO4 100 mM, Nonidet P-40 al 0,5 % e inhibidor de proteasa Complete Mini (Roche Applied Science)). Para la detección de Ac-FoxO1, los tejidos se homogeneizaron en tampón que contenía NAM 10 mM y tricostatina A 1 μM. Para el fraccionamiento nuclear, las células se lisaron en tampón (HEPES 10 mM, pH 7,9, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM, DTT 0,5 mM , Nonidet P-40 al 0,05 %, NAM 10 mM, tricostatina A 1 μM e inhibidor de proteasa Complete Mini), se incuba a 4 °C durante 10 min y se centrifuga a 4 °C a 800 g durante 10 min. El sedimento se resuspendió en tampón (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5 %, Nonidet P-40 al 1 % y SDS al 0,1 %, NAM 10 mM, tricostatina A 1 μM e inhibidor de la proteasa Complete Mini), se incubó a 4 °C por 30 min y se centrifugó a 4 °C a 10.400 g por 20 min. El sobrenadante se dividió en alícuotas como la fracción nuclear. Para la preparación de muestras de proteínas a partir de plasma de ratón, proteínas plasmáticas superfluas (albúmina, IgM, IgG, IgA, haptoglobina, transferrina, α1-antitripsina, fibrinógeno, α 2-macroglobulina, α1-glucoproteína ácida, apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, complemento C3 y transtiretina ) se agotó utilizando el sistema de cartucho giratorio de extracción por afinidad múltiple (Agilent Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las muestras de proteínas se fraccionaron con SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare Biosciences). Las membranas transferidas se incubaron con anticuerpo primario, seguido de anticuerpo IgG anti-ratón o anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Las señales inmunorreactivas se detectaron con el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus (GE Healthcare Biosciences) y se visualizaron con un analizador de imágenes luminosas (ImageQuant LAS 4000 mini; GE Healthcare Biosciences). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-PBEF policlonal de conejo (Bethyl Laboratories, Inc.), anticuerpo anti-Sirt1 policlonal de conejo (Merck Millipore), anticuerpo anti-GAPDH policlonal de conejo (Abcam), anticuerpo anti-Ac-FoxO1 policlonal de conejo ( Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anticuerpo monoclonal de conejo anti-FoxO1 (Cell Signaling Technology, Inc.), anticuerpo policlonal de conejo anti-Ac-K (Cell Signaling Technology, Inc.) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-histona H3 (Cell Signaling Technology, Inc.) Tecnología, Inc.).

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Life Technologies, Inc.) y se trató con ADNasa para eliminar el ADN genómico contaminante con el kit sin ADN TURBO (Life Technologies, Inc.). El ADNc monocatenario se transcribió utilizando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Life Technologies, Inc) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realizamos un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real utilizando el Light Cycler TaqMan Master Kit (Roche Applied Science) con los cebadores específicos del objetivo y las sondas coincidentes diseñadas por Universal ProbeLibrary System (Roche Applied Science), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones de amplificación fueron desnaturalización inicial durante 10 min a 95 °C seguida de 45 ciclos de 10 s a 95 °C y 25 s a 60 °C. Los productos de PCR individuales se analizaron mediante análisis del punto de fusión. El nivel de expresión de un gen se normalizó en relación con el del ARNr de 28S de rata y Gapdh de ratón mediante el uso de un método Ct comparativo. Las secuencias de los cebadores y los números de Universal Probe se diseñaron con el software ProbeFinder de la siguiente manera: ratón Nampt, 5′-cctgttccaggctattctgttc-3′ y 5′-atggtctttcccccaagc-3′, No. 84; ratón Sirt1, 5′-cgtggagacatttttaatcaggta-3′ y 5′-gcttcatgatggcaagtgg-3′, No. 104; ratón Gapdh, 5′-tgtccgtcgtggatctgac-3′ y 5′-cctgcttcaccaccttcttg-3′, No. 80; ratón Sod2, 5′-gacccattgcaaggaacaa-3′ y 5′-gtagtaagcgtgctcccacac-3′, No. 3; ratón Ppargc1a, 5′-gaaagggccaaacagagaga-3′ y 5′-gtaaatcacacggcgctctt-3′, No. 29; ratón Tfam, 5′-caaaggatgattcggctcag-3′ y 5′-aagctgaatatatgcctgcttttg-3′, No. 94; ratón Pparg, 5'-aagacaacggacaaatcacca-3' y 5'-gggggtgatatgtttgaacttg-3', No. 7; ratón Nrf-1, 5′-tggagtccaagatgctaatgg-3′ y 5′-gcgaggctggttaccaca-3′, No.100; ratón Esrra, 5′-ccttccctgctggacctc-3′ y 5′-cgacaccagagcgttcact-3′, No. 78; ratón mt-Co3, 5′-tagcctcgtaccaacacatga-3′ y 5′-agtggtgaaattcctgttgga-3′, No. 66; ratón Itgam, 5′-aaggatgctggggaggtc-3′ y 5′-gtcataagtgacagtgctctggat-3′, No. 16; ratón Emr1, 5′-cctggacgaatcctgtgaag-3′ y 5′-ggtgggaccacagagagttg-3′, No. 1; ARNr de 28S de rata, 5'-gctggctaggcagacaacat-3' y 5'-gacctgacgatgacagaggaa-3', No. 107; rat Sod2, 5′-tggacaaacctgagccctaa-3′ y 5′-gacccaaagtcacgcttgata-3′, No. 67; Ppargc1a de rata, 5'-aaagggccaagcagagaga-3' y 5'-gtaaatcacacggcgctctt-3', nº 29; rata Tfam, 5'-tcggtcagcatataacatttacg-3' y 5'-caagcctgatttacaagcttca-3', No. 79; Pparg de rata, 5'-cccaatggttgctgattaca-3' y 5'-ggacgcaggctctactttga-3', nº 125; rata Nrf1, 5'-atagtcctgtctggggaaacc-3' y 5'-tccatgcatgaactccatct-3', No. 109; rat Esrra, 5′-ggtggacccattgccttt-3′ y 5′-caccagggcgttaactgg-3′, No. 78; rat mt-Co3, 5′-taaacccaagcccatgacc-3′ y 5′-agccggatgtaagtagaagagc-3′, No. 92.

Los niveles de NAD+ y NMN se determinaron utilizando un sistema HPLC (Shiseido Co., Ltd.) con una columna CAPCELL PAK C18 MGIII S5 (15 cm × 2,0 mm; Shiseido) y una columna YMC-Pack Pro C18 RS (15 cm × 4,6 mm ; YMC Co., Ltd.), respectivamente, como se describió anteriormente10. Se extrajeron tejidos congelados o plasma recién recogido de ratones, o cardiomiocitos cultivados en ácido perclórico 1 M (200 μl/10 mg de tejido, 100 μl/10 μl de plasma, 500 μl/placa de 6 cm). Los extractos se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 min a 4 °C y los sobrenadantes resultantes se neutralizaron en K2CO3 3 M sobre hielo durante 10 minutos. Después de aclarar los extractos, se mezclaron alícuotas de 100 μl con 50 μl de tampón A (50 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7,0) y 50 μl de agua. Para la medición de NAD+, la HPLC se ejecutó a una velocidad de flujo de 200 μl/min con 100 % de tampón A de 0 a 5 min, un gradiente lineal a 95 % de tampón A/5 % de tampón B (100 % de metanol) de 5 a 6 min, 95 % de tampón A/5 % de tampón B de 6 a 11 min, un gradiente lineal a 85 % de tampón A/15 % de tampón B de 11 a 13 min, 85 % de tampón A/15 % de tampón B de 13 a 23 min y un gradiente lineal al 100 % del tampón A de 23 a 24 min. Para la medición de NMN, la HPLC se ejecutó a una velocidad de flujo de 700 μl/min con 100 % de tampón A de 0 a 5 min, un gradiente lineal a 60 % de tampón A/40 % de tampón B de 5 a 10 min, 60 % de tampón A/40 % de tampón B de 10 a 32,5 min, un gradiente lineal a 100 % de tampón A de 32,5 a 35 min. Normalmente, NAD+ y NMN se eluyeron a los 14 min y 25 min, respectivamente. Los niveles de NAD+ y NMN se cuantificaron en función del área del pico en comparación con una curva estándar y se normalizaron al peso de los tejidos congelados, el volumen de plasma y el número de cardiomiocitos cultivados.

La actividad desacetilasa de Sirt 1 se determinó con el kit de descubrimiento de fármacos/ensayo de actividad fluorescente SIRT1 (Enzo Life Science International) basado en el péptido sustrato Fluor de Lys-SIRT1. Se incubaron extractos de proteína (10 µg) de corazón de ratón o cardiomiocitos neonatales de rata con el sustrato de péptido acetilado fluorogénico. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 1 h y la señal fluorescente se midió con una excitación de 360 nm y una emisión de 460 nm en un lector de placas de fluorescencia (SH-9000Lab, Hitachi High-Technologies Corporation).

Se recogió sangre periférica de ratón y las células mononucleares se separaron usando Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich). Brevemente, se depositó cuidadosamente 1 ml de sangre total sobre 5 ml de Histopaque 1083 en un tubo de centrífuga y el tubo se centrifugó a 400 g durante 30 min a temperatura ambiente. La interfaz opaca, que contenía la banda de células mononucleares, se recogió utilizando una pipeta Pasteur. La separación de los monocitos CD11b+ se logró clasificando utilizando el sistema MACS (Miltenyi Biotech). Las células mononucleares se incubaron con anticuerpo anti-CD11b de rata (Merck Millipore) durante 20 min a 4 °C, se lavaron en PBS suplementado con FBS al 3 %, se incubaron con microesferas anti-rata durante 20 min a 4 °C y se lavaron en PBS. suplementado con 3% FBS. Las muestras se pasaron a través de una columna MACS MS (Miltenyi Biotech) configurada en un imán Miltenyi y los monocitos CD11b+ se eluyeron de la columna lavando con PBS suplementado con FBS al 3%.

Se realizó el ensayo TUNEL con tinción nuclear con DAPI, utilizando el kit de detección de apoptosis in situ (Takara Bio Inc.). Los corazones se extirparon y se incrustaron inmediatamente en el compuesto criogénico Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek Japón). Las secciones congeladas frescas a 5 μm se fijaron con acetona durante 30 min a temperatura ambiente y luego se lavaron con PBS durante 30 min. Las secciones se incubaron con H2O2 al 0,3 % en metanol durante 30 min a temperatura ambiente para bloquear la peroxidasa endógena y luego se lavaron tres veces con PBS durante 5 min. Después de la incubación en tampón de permeabilización durante 5 min en hielo, las secciones se colocaron en una cámara humidificada y se incubaron con la enzima TdT que incluye dUTP conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 60 min a 37 °C. Para diferenciar entre la apoptosis en miocitos y no miocitos, las secciones de tejido también se tiñeron con aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada con Alexa Fluor 594 (Life Technologies, Inc.) durante 60 minutos a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos. mín. Finalmente, las secciones se montaron con ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies, Inc.). Las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia (FSX100; Olympus) y el software Olympus FSX-BSW (Olympus).

La sangre total obtenida por punción cardíaca se tamponó con EDTA, se sometió a lisis de glóbulos rojos utilizando la solución de lisis BD FACS (BD Biosciences) y se lavó en PBS suplementado con suero de ternero fetal al 3 %. Primero se incubaron leucocitos sanguíneos con anticuerpo FcR/III anti-ratón de rata (2.4G2) (BD Biosciences) para minimizar la unión no específica del anticuerpo a FcR. Se incubaron adicionalmente con anticuerpo anti-CD11b conjugado con APC (BD Biosciences) y anticuerpo anti-F4/80 conjugado con PE (BD Biosciences) durante 10 min en hielo y se lavaron con PBS suplementado con suero de ternero fetal al 3 %. Los porcentajes de células CD11b+ y F4/80+ se analizaron mediante el citómetro de flujo FACS Canto II (BD Biosciences) usando el software EXPO32 (Beckman Coulter).

Todos los datos se presentan como media ± SEM. La comparación de dos grupos se analizó mediante la prueba t de Student de 2 colas para datos no apareados y la comparación de grupos múltiples se realizó mediante ANOVA de 1 vía seguido de la prueba HSD de Tukey-Kramer para la comparación de medias. Se estimaron las curvas de supervivencia por el método de Kaplan-Meier y se compararon los grupos por la prueba de Wilcoxon generalizada. Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Cómo citar este artículo: Yano, M. et al. La biosíntesis de NAD+ dependiente de Namt extracelular derivada de monocitos protege al corazón contra la sobrecarga de presión. ciencia Rep. 5, 15857; doi: 10.1038/srep15857 (2015).

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Departamento de Medicina Cardiovascular, Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japón

Masamichi Yano, Toru Oka, Chizuru Yabumoto, Yoko Kudo-Sakamoto y Yasushi Sakata

Departamento de Medicina Cardiovascular, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Tokio, Tokio, 113-8655, Bunkyo-ku, Japón

Hiroshi Akazawa, Takehiro Kamo, Yu Shimizu, Hiroki Yagi, Atsuhiko T. Naito e Issei Komuro

Unidad de Educación en Farmacia Clínica, Escuela de Graduados en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japón

Chizuru Yabumoto

Departamento de Medicina Regenerativa Cardiovascular, Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japón

Atsuhiko T. Naito y Jong-Kook Lee

Departamento de Terapéutica y Ciencias Clínicas Avanzadas, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokio, Tokio, 113-8655, Bunkkyo-ku, Japón

Jun-ichi Suzuki

AMED-CREST, Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico, Tokio, 100-0004, Chiyoda-ku, Japón

Hiroshi Akazawa, Toru Oka, Atsuhiko T. Naito, Jong-Kook Lee e Issei Komuro

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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Yano, M., Akazawa, H., Oka, T. et al. La biosíntesis de NAD+ dependiente de Namt extracelular derivada de monocitos protege al corazón contra la sobrecarga de presión. Informe científico 5, 15857 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15857

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Recibido: 17 julio 2015

Aceptado: 05 de octubre de 2015

Publicado: 02 noviembre 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15857

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