Nuevo modelo de cortical

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7809 (2023) Citar este artículo

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Los organoides corticales humanos (hCO), derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC), proporcionan una plataforma para interrogar los mecanismos del desarrollo del cerebro humano y las enfermedades en tejidos tridimensionales complejos. Sin embargo, los métodos actuales de desarrollo de hCO carecen de tejidos no neurales importantes, como la capa meníngea circundante, que se ha demostrado que son esenciales para la corticogénesis y el desarrollo cerebral normales. Aquí, primero generamos hCO a partir de una sola roseta para crear organoides más homogéneos con un tamaño constante de alrededor de 250 µm en el día 5. Luego aprovechamos un sistema de cocultivo 3D para encapsular organoides cerebrales con una capa delgada de células meníngeas de la misma primeras etapas del desarrollo cortical. Se realizó un análisis de inmunotinción para mostrar diferentes marcadores de capa cortical durante diferentes etapas de desarrollo. El monitoreo en tiempo real del desarrollo de organoides usando IncuCyte mostró una morfología mejorada y una mayor tasa de crecimiento con el tiempo. Descubrimos que los organoides encapsulados en meníngea ilustraban una mejor organización laminar al exhibir una mayor expresión de REELIN por las neuronas de Cajal-Retzius. La presencia de células meníngeas resultó en una mayor expansión de las células progenitoras intermedias (IPC) TBR2, la capa cortical profunda (CTIP2) y la capa cortical superior (BRN2). Finalmente, los organoides encapsulados en meníngeas mejoraron la formación de astrocitos y glía radial externa ilustrada por una expresión más fuerte de los marcadores HOPX y GFAP, respectivamente. Este estudio presenta una nueva plataforma de cocultivo 3D para imitar más de cerca la estructura cerebral cortical in vivo y permitirnos investigar mejor los mecanismos subyacentes a los trastornos del desarrollo neurológico durante el desarrollo embrionario.

El cerebro humano está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas neuronas, astrocitos, microglía y oligodendrocitos. Los sistemas organoides cerebrales actuales derivados de células madre pluripotentes proporcionan importantes modelos in vitro para recapitular la corteza humana en desarrollo, lo que nos permite estudiar el desarrollo del cerebro tanto en condiciones sanas como enfermas1,2,3,4,5. Sin embargo, existen varias limitaciones en los sistemas modelo in vitro actuales que pueden afectar su reproducibilidad y aplicabilidad. Una de esas limitaciones es la variabilidad de lote a lote que puede surgir debido a las diferencias en las poblaciones celulares iniciales, las condiciones de cultivo y las propiedades de autoorganización de las células6,7. Abordar esta limitación es crucial para desarrollar organoides como modelos confiables para estudiar el cerebro humano. La introducción del enfoque basado en una sola roseta nos ha permitido generar organoides más consistentes y reproducibles que dan como resultado organoides más homogéneos y definidos que imitan mejor los aspectos del desarrollo temprano del cerebro.

Otra limitación del modelo organoide es la falta de diversidad celular completa que se observa en el cerebro humano8. Si bien los organoides pueden generar algunos de los tipos de células que se encuentran en el cerebro humano, no todos los tipos de células están representados. Esto puede limitar la transducción de señales adecuada necesaria para recapitular completamente los aspectos arquitectónicos y de desarrollo del cerebro humano con la complejidad adecuada. Para superar esta limitación, nuestro enfoque consiste en incorporar las células meníngeas como un tipo de célula importante que desempeña un papel fundamental en el desarrollo del cerebro. Las meninges, un tipo de célula cerebral no neuronal, están presentes desde las primeras etapas embrionarias del desarrollo cortical y parecen ser necesarias para la corticogénesis normal y la formación de estructuras cerebrales9,10,11,12. Estudios recientes han identificado un nicho no parenquimatoso de la población de NSC dentro de las meninges que expresan marcadores neurales precursores capaces de generar nuevas neuronas in vitro e in vivo13,14. Durante el desarrollo del cerebro, las meninges juegan un papel crucial en el desarrollo de hCO al liberar varios factores morfogénicos necesarios para la corticogénesis. Estudios in vitro han demostrado que las células meníngeas pueden secretar FGF-215, IGF216,17, CXCL1218,19,20,21 y ácido retinoico22,23,24 que son esenciales para una corticogénesis adecuada. Los estudios in vivo también han demostrado que las meninges secretan una gran cantidad de moléculas de señalización, incluido Sonic hedgehog (Shh), que desempeña un papel clave en el desarrollo del prosencéfalo ventral, y la familia de proteínas morfogenéticas óseas (BMP), que regula la función dorsal-ventral. patrón del tubo neural 25. Otros factores secretados por las meninges incluyen miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), Wnt y Notch, que están involucrados en la regulación de la proliferación, diferenciación y supervivencia celular en varios procesos de desarrollo, incluida la neurogénesis1,26,27,28, 29 Se plantea la hipótesis de que las áreas enriquecidas con laminina en las meninges son esenciales para regular la liberación de estos factores. Por lo tanto, la presencia de meninges parece ser crucial para el desarrollo de organoides cerebrales30.

El método de cocultivo para combinar diferentes regiones del cerebro dentro de un solo tejido organoide ha demostrado anteriormente que modela interacciones complejas entre diferentes regiones y estudia defectos del desarrollo neurológico31. Por ejemplo, mediante el uso de indicadores fluorescentes, se ha demostrado que las interneuronas GABAérgicas dependientes de CXCR4 migran del prosencéfalo ventral al dorsal, y esto se ha utilizado para estudiar enfermedades neurológicas y probar posibles terapias32. Sin embargo, nadie ha estudiado el uso de células meníngeas en combinación con organoides cerebrales para investigar el efecto de estas células en el desarrollo de organoides cerebrales. En este estudio, aprovechamos un sistema de cultivo conjunto para generar organoides cerebrales corticales en combinación con células meníngeas y estudiamos el papel de las células meníngeas en la progresión de la organización laminar del desarrollo cerebral temprano en un sistema modelo.

En este estudio se utilizaron tres líneas celulares de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). CC1 y CHD2 se obtuvieron de biopsias de piel de diferentes individuos y PCDH19-WT (fibroblastos de prepucio disponibles comercialmente) fueron generados previamente por miembros del laboratorio y20,21. Todas las líneas celulares iPSC se realizaron con la aprobación previa de la Junta de Revisión Institucional de Michigan Medicine. Las iPSC se cultivaron en una dilución 1:200 de una placa de 30 mm recubierta con Geltrex (Fisher Scientific) y en TeSR™-E8™ (StemCell Technologies). Las células se sometieron a pases de forma rutinaria una vez por semana y se usaron antes del número de pases 35 para todos los experimentos.

Las células meníngeas humanas se derivan directamente de las leptomeninges humanas y están disponibles comercialmente (catálogo ScienCell n.º 1400). Las células leptomeníngeas se crioconservaron en el pase uno y se entregaron congeladas. Cada vial contiene > 5 × 105 células en un volumen de 1 ml. HMC se caracterizaron por inmunofluorescencia; todos son positivos para fibronectina y negativos para GFAP y α-actina de músculo liso. Se compraron 5 × 105 células/ml (1 ml/vial) en el paso cero, se expandieron en medio de células meníngeas MenCM que constaba de 500 ml de medio basal, 10 ml de suero fetal bovino y 5 ml de suplemento de crecimiento de células meníngeas y 5 ml de medio de penicilina/estreptomicina (catálogo ScienCell #1404) y se usaron hasta el paso número tres.

Para generar organoides corticales, se utilizaron iPSC indiferenciadas con una confluencia del 70-80%. Para comenzar con la preparación de la placa, se colocaron 30 µl de Geltrex concentrado al 100 % en el medio de cada pocillo de una placa de 12 pocillos y se dejó en la incubadora durante 20 min para que solidificara como una burbuja. Luego, se usó Geltrex diluido en DMEM/F12 (1:100) para recubrir el resto de la superficie alrededor de la burbuja de Geltrex. Luego, las células iPSC se disociaron en placas recubiertas con Geltrex mediante Accutase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), y se agregaron 8 × 105 células en medio TeSRTM-E8TM alrededor de la burbuja y no directamente en la burbuja y se dejaron en la incubadora durante 24 h para asentarse. A continuación, el medio celular se cambió a medio de inducción neural con vitamina A 3N que contenía dorsomorfina 1 µM y SB431542 10 µM como se describe en 22 con algunas modificaciones. (Los detalles del medio 3N se muestran en la Tabla de datos complementarios 1). El medio se intercambió todos los días con 2 ml de medio fresco. Después de 24 h, empezaron a surgir rosetas individuales cerca de la burbuja de Geltrex y se observó que el tamaño de las rosetas aumentaba cada día. Las rosetas individuales más cercanas a la burbuja sólida de Geltrex eran visiblemente más grandes que otras rosetas. Después de 5 días, estas rosetas individuales más grandes se recogieron manualmente y se transfirieron individualmente a pocillos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pocillos con medio de inducción neural de 3N + vitamina A. El medio se actualizó cada dos días, durante 3 días.

En el cuarto día después del paso celular, las células meníngeas se separaron utilizando Accutase (Innovative Cell Technologies) y se añadieron a rosetas individuales en suspensión (células iPSC ¿día 8?). Para determinar el número óptimo de células meníngeas para coincubar con células iPSC, la mitad de los pocillos recibió 8 × 103 células meníngeas y la otra mitad se quedó sin células meníngeas como control. El medio era 50 % de medio de células meníngeas y 50 % de 3N + vitamina A. Los medios meníngeos que contenían 2 % de FBS que se añadieron mitad y mitad con 3N llevaron la concentración de FBS al 1 %. Este medio que contenía FBS se agregó durante solo 3 días (entre los días 9 y 11) y se consideró la misma condición para la condición de control. El día 9, el cocultivo de organoides y células meníngeas se agregó a un sistema IncuCyte Zoom (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, EE. UU.) para la incubación y la obtención de imágenes. Se obtuvieron imágenes cada tres horas durante los primeros tres días (días 9 a 11) y luego cada ocho horas hasta el día 42. A partir del día 12, el medio se actualizó una vez al día con 3N + vitamina A + 10 ng/ml de BDNF + NT3 10 ng/ml. Al final del día 42, los organoides se transfirieron a placas de fondo redondo de 48 pocillos, con el mismo medio y se colocaron en la incubadora sin IncuCyte, debido a las limitaciones de tamaño de imagen de IncuCyte. Los organoides se fijaron los días 42, 56 y 70 respectivamente para un análisis de imagen adicional.

Los organoides se fijaron en paraformaldehído (PFA) frío al 4% en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) durante 20 min y luego se lavaron dos veces en PBS durante 5 min. Luego, los organoides fijados se incubaron durante la noche a 4 ° C en sacarosa al 30 % en PBS. Al día siguiente, los organoides se retiraron de la sacarosa y se incrustaron y congelaron en Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature Compound (OCT, Sakura), se seccionaron criogénicamente a 20 µm de espesor y se recolectaron en portaobjetos Superfrost Plus (Fisher Scientific). Los portaobjetos se enjuagaron con Triton-X100 al 0,1 % (Sigma) durante 20 min a temperatura ambiente para aumentar la permeabilidad y luego las secciones se incubaron en tampón de bloqueo ICC (PBS con Tween-20 al 0,05 %, suero de cabra normal al 5 % y BSA al 1 %). ) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. La especie de anticuerpo, la dilución, el nombre del proveedor y los números de catálogo se incluyen en la Tabla de datos complementarios 2. Luego, las células se lavaron con PBST (Tween 20 al 0,05 % en PBS) tres veces durante 10 minutos cada una, seguido de incubación con anticuerpos secundarios diluidos en la solución de bloqueo para 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, los portaobjetos se lavaron una vez con PBST durante 10 min y se incubaron durante 5 min en PBS con bisbenzimida para marcar los núcleos. Finalmente, los portaobjetos se lavaron tres veces durante 10 min cada uno en PBST y luego se montaron en medio de montaje Glycergel, se tomaron imágenes usando microscopía confocal (descrito a continuación) y se dejaron secar durante la noche para obtener más imágenes.

El sistema IncuCyte Zoom es una plataforma que permite obtener imágenes en tiempo real de esferoides utilizando fluorescencia de dos colores o sin etiquetas para observar la morfología y estudiar el crecimiento de esferoides a lo largo del tiempo. Aquí, el sistema monitoreó el crecimiento de rosetas. La morfología y la sección transversal promedio de cada organoide en diferentes puntos de tiempo sobre la diferenciación se observaron y analizaron utilizando el software del sistema IncuCyte Zoom. Todos los datos de IncuCyte se obtuvieron de cinco experimentos independientes con al menos seis muestras en cada condición.

Las secciones se examinaron con un microscopio de escaneo láser confocal Leica TCS SP5 vertical + sistema invertido (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania) utilizando un procedimiento de escaneo secuencial. Las imágenes confocales se tomaron con lentes de 10x y 20x y los datos fueron analizados por ImageJ. Las imágenes confocales se adquirieron utilizando microscopios confocales Zeiss LSM 700, LSM 780 o Zeiss LSM 800 equipados con una platina motorizada y el software Zen Black o Blue Edition. Las imágenes en mosaico se ensamblaron utilizando el módulo Zen Tiles and Positions. Para las imágenes de campo claro, se utilizó un microscopio EVOS (Advanced Microscopy Group). Todas las imágenes se compilaron en Adobe Photoshop, con ajustes de imagen aplicados a toda la imagen y restringidos a brillo, contraste y niveles. Las imágenes que se muestran en las figuras como comparaciones se obtuvieron y procesaron en paralelo utilizando configuraciones idénticas.

Se utilizó Prism versión 8.4.2 (GraphPad) para todos los análisis estadísticos. Para todos los demás estudios, la diferencia significativa entre los grupos de prueba se evaluó utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas. El valor de AP < 0,05 se consideró estadísticamente diferente. Estos experimentos se repitieron cuatro veces con tres líneas celulares diferentes. (CC1 n = 2, PCDH19 n = 1 y CDH2 n = 1). A todos se les realizaron inmunotinciones. Aunque hubo ligeras diferencias en el tamaño de los organoides con diferentes líneas celulares, como se muestra en los datos complementarios S1, todas las líneas celulares mostraron la misma tendencia en las etapas de diferenciación y diferentes marcadores. En este estudio, se recopilaron y utilizaron datos de las tres líneas celulares. Se seleccionaron al menos n = 4 organoides de cada experimento (n = 4 réplicas biológicas en total y n = 12 número de organoides que se mencionan en detalle en las leyendas de las figuras). Por lo tanto, cada gráfico representa el promedio y la desviación estándar después del análisis de 18 organoides individuales.

Todos los experimentos y métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos, y todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y normas pertinentes de REC.

Diseñamos un método para generar estructuras de rosetas neurales individuales a partir de los tres iPSC (CC1, PCDH19-WT, CHD2) para replicar la región cerebral cortical. Las rosetas neuronales por sí mismas carecen de la capacidad de organizarse espacialmente en distintas capas neuronales, pero son el punto de partida para el organoide cerebral 3D23 y pueden ser indicadores útiles para identificar células potencialmente de apoyo para sistemas de cocultivo. Para diferentes factores de crecimiento e inhibidores, modificamos los métodos descritos por Yichen Shi33. En resumen, las iPSC se trataron con inhibición dual de SMAD (dorsomorfina y SB431542), que es un método bien establecido para derivar células progenitoras neurales a partir de iPSC. En la (Fig. 1a) se muestra un diagrama esquemático del método de cultivo. Rosetas individuales comenzaron a elevarse a partir del día dos cerca de la interfaz entre la burbuja de Geltrex sólido y Geltrex/DMEM diluido (Fig. 1b) y crecieron con el tiempo. Se tomaron datos de cuatro experimentos independientes de células CC1 marcadas con GFP (Fig. 1d) y se analizó el número total de n = 18 rosetas. El diámetro medio de la roseta para la línea celular CC1 el día 2 fue de 170 ± 20 µm y aumentó a > 250 µm el día 5 (Fig. 1c). La observación morfológica mostró estructuras de luz bien definidas en el medio de las rosetas (Fig. 1c, g). En general, las rosetas individuales tuvieron un aumento de tamaño > 1,8 veces desde el día 3 al 5, lo que demostró ser significativo (p < 0005). (Figura 1f). Estos datos se confirmaron con dos líneas iPSC adicionales (PCDH19 y CHD2). Los datos de estas dos líneas se muestran en (Fig. S1 complementaria). Para caracterizar la aparición de rosetas neurales, llevamos a cabo un análisis del curso del tiempo en diferentes marcadores de células madre/progenitoras neurales (NPC). Solo 2 días después de la inducción dual de SMAD, las rosetas derivadas de iPSC comenzaron a mostrar la expresión de los marcadores neuroectodérmicos PAX6 y NESTIN NPC y el marcador de membrana apical PKC-Z (Fig. 1e1). En el día cinco, se observó una estructura de tipo neuroepitelial polarizada bien definida con una expresión distinguida de PAX6 y NESTIN NPC en la zona ventricular (VZ) y una fuerte expresión de marcadores de unión adherente de N-cadherina y PKC-Z en la región apical que se asemejaba a tubos neurales (Fig. 1e2, g).

Generación y Caracterización de rosetas neurales simples. (a) Diagrama esquemático del método de cultivo para generar organoides corticales humanos, (b) aparición y crecimiento de rosetas individuales durante cinco días en la interfaz entre la burbuja y Geltrex diluido, (c) imagen representativa de una sola roseta que ilustra el tamaño promedio de cada roseta única que mide alrededor de 255 µm, (d) imagen representativa de rosetas marcadas con GFP, (f) análisis cuantitativo del crecimiento de roseta única en micrómetros desde el día dos hasta el quinto. Los datos se representan como media ± SD. El análisis estadístico mostró una diferencia significativa en el tamaño de los días 3 a 4 y 4 a 5 (****p < 001, n = 4 experimentos independientes y n = 4 rosetas fueron seleccionados de cada experimento), (e1, e2) Inmunotinción de rosetas individuales en el día 2 y día 5 para NPC (PAX6 y NETIN) y membrana apical (NCAD/APKC), (g) Rosetas individuales expresan PAX6 y N-cadherina, barra de escala de 100 µm, y (h) IncuCyte Zoom imágenes representativas de crecimiento de organoides en placas de 96 pozos en diferentes puntos de tiempo desde el día 9 hasta el día 22. (i) Cuantificación del tamaño de rosetas individuales después de que las rosetas se hayan aclimatado a su entorno 3D, comenzando en el día 9 (n = 3 experimentos independientes de líneas celulares CC1 y n = 9 organoides en total). Barras de error ± SD. Barra de escala 400 µm.

Las rosetas individuales se transfirieron a placas de fondo redondo de 96 pocillos el día 5 y los cambios morfológicos se analizaron durante 14 días utilizando el sistema IncuCyte Zoom. Se tomaron imágenes de cada roseta cada 12 h. Las rosetas demostraron un crecimiento de tamaño con el tiempo y las rosetas casi cuadruplicaron el área de la sección transversal entre los días 9 y 24 (Fig. 1h). La cuantificación del tamaño de las rosetas individuales después de que las rosetas se hayan aclimatado a su entorno 3D, a partir del día 9, mostró un aumento en el diámetro del tamaño de alrededor de > 800 µm para el día 24 (Fig. 1i). Nuestro enfoque para generar organoides corticales a partir de rosetas individuales parece producir rápidamente organoides homogéneos y producir rosetas neuroepiteliales organizadas bien definidas.

Para evaluar aún más el protocolo, examinamos si nuestro método podría generar diferentes regiones corticales y recapitular la corteza fetal humana (Fig. 2b). Realizamos análisis inmunohistoquímicos de marcadores corticales específicos en diferentes momentos. En el día 21, observamos una expresión clara de los marcadores neuroprogenitores PAX6 y BLBP, el marcador del cerebro anterior FOXG1 y la aparición del marcador neuronal TUJ1 (Fig. 2a). Estudios anteriores han demostrado que TBR2 es un factor crítico para la especificación de células progenitoras basales intermedias (IPC) en una corteza en desarrollo. Se sabe que TBR2 regula la morfogénesis de cada capa cortical34,35,36. En el día 42, las células dentro del organoide se segregaron en distintos progenitores PAX6 en VZ con IPC TBR2 prominentes en la zona subventricular (SVZ) (Fig. 2c). También se observaron en el día 42 expresiones claras del marcador del cerebro anterior FOXG1 y el marcador neuronal TUJ1 (Fig. 2d). Además, la expresión de MAP2, un indicador de la población de neuronas, comenzó el día 42 y aumentó significativamente (P <0,005) el día 70 (Fig. 2e, f).

Inmunotinción para marcadores específicos de región e identidades de células neuronales. ( a ) Rosetas individuales inmunoensayadas el día 21 mostraron expresión de marcadores de glía radial general (RG) (PAX6 y BLBP), y marcador de prosencéfalo FOXG1 y marcador neuronal TUJ1. ( b ) Expresión esquemática de diferentes regiones del cerebro. ( c ) La inmunotinción de organoides en el día 42 mostró una expresión clara de RG (PAX6) en VZ e IPC (TBR2) iSVZ. ( d ) Marcador del cerebro anterior FOXG1 y marcador neuronal TUJ1 identificados en la VZ el día 42. ( e ) Los organoides cerebrales se tiñeron conjuntamente para el marcador neuronal MAP2 y PAX 6 el día 42 (S6) y 70 (S10). ( f ) La cuantificación de la expresión de MAP2 mostró una diferencia significativa en W10 frente a W8 (P <0.005), ( g ) Los organoides cerebrales se tiñeron conjuntamente para el marcador neuroepitelial (NESTIN) y el marcador RG externo (HOPX). ( h ) La cuantificación del grosor relativo de HOPX mostró una diferencia significativa entre tres puntos de tiempo diferentes, W6, W8 y W10 (P <0.005), (i) los organoides cerebrales se tiñeron conjuntamente para el marcador de neurona de capa inferior (CTIP2) y la capa externa marcador de neuronas (SATB2) en los días 42, 56 y 70, (j, k) la cuantificación estadística del grosor relativo de cada capa mostró ser significativa entre tres puntos de tiempo diferentes, W6, W8 y W10 (P < 0,005). (n = 4 réplicas biológicas en total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 y n = 1 CHD2, n = 12 número total de organoides analizados). Barras de error ± SD. La barra de escala es de 100 µm para todas las figuras.

Además evaluamos la expresión de HOPX en nuestro sistema de cultivo celular. En los seres humanos, SVZ, un contribuyente clave para el crecimiento neocortical humano, se divide en secciones internas y externas denominadas iSVZ y oSVZ, respectivamente37. Estudios recientes han demostrado que la presencia de células gliales radiales externas (oRGC) es responsable de la generación de la mayoría de las neuronas corticales en la capa oSVZ similar a la corteza humana en desarrollo en las semanas gestacionales 15-2038. HOPX es uno de los marcadores característicos importantes de oRGCs4,39. Detectamos muy poca expresión de HOPX en el día 42, sin embargo, se detectó una clara aparición de HOPX en el día 56 tanto en la zona ventricular (VZ) como en la SVZ. Para el día 70, la expresión de HOPX se expandió significativamente (P <0.005) y se detectó más en la zona subventricular externa (región similar a oSVZ) que parecía estar separada de la región SVZ interna (iSVZ) (Fig. 2g, h). Además, en el día 42, hay una expresión clara de las neuronas marcadoras de la capa inferior CTIP2 formadas por encima de la VZ y SVZ que se asemejan a la preplaca (PP), cuya expresión aumentó significativamente (p < 0,005) desde el día 56 (S8) hasta el día 70 (S10). ) (Figura 2g). Finalmente, el marcador de la capa superior SATB2 surgió alrededor del día 42 y aumentó significativamente entre S8 y S10 (p < 0,005) (Fig. 2g). En las figuras complementarias se muestran imágenes adicionales alejadas de organoides corticales humanos completos (hCO) para todos los marcadores. S2 y S3. Juntos, estos resultados demuestran que nuestro sistema organoide generado a partir de rosetas individuales recapitula el desarrollo cortical humano y la expresión modelada de marcadores de desarrollo humano cruciales in vivo.

Para imitar mejor la formación in vitro de organoide cortical humano, utilizamos además células meníngeas humanas en cocultivo con nuestro método de formación de roseta única para explorar el efecto de las células no neuronales para ayudar al desarrollo del cerebro humano. Para este experimento se utilizaron células meníngeas de leptomeninges humanas. Se ha demostrado que las células meníngeas son la fuente de señales de desarrollo que regulan la diferenciación y maduración cortical14. También se ha demostrado que las señales de diferentes capas meníngeas son cruciales para la formación adecuada de diferentes regiones del cerebro40,41,42. Por ejemplo, señales neurogénicas como el ácido retinoico de la capa meníngea media regulan la generación de neuronas corticales22. Queríamos ver si el cultivo conjunto de células meníngeas y la presencia de señales de orientación de estas células pueden proporcionar un mejor andamio para la migración de RG y mejorar la maduración del organoide neural en capas discretas separadas. Con este fin, agregamos células meníngeas de células individuales (~ 8000) a rosetas individuales aisladas en placas de 96 pocillos de fondo redondo en el día 9 y monitoreamos su unión en 2, 3 y 6 h. intervalos por IncuCyte Zoom. Cabe mencionar que inicialmente se examinaron diferentes números de células meníngeas para definir el número de células óptimo para estos experimentos, y se demostró que la adición de más células (16 000, 32 000 y 100 000 células meníngeas) dio como resultado rosetas de menor tamaño, quizás debido a la menos espacio para que crezcan los organoides (Figura complementaria S4a, b). Por lo tanto, se eligieron 8000 células meníngeas como el número óptimo de células para cocultivar con organoides. En la (Fig. 3a) se muestra un diagrama esquemático del procedimiento experimental. Observamos que la mayoría de las células meníngeas se adhieren y cubren las rosetas individuales en las primeras 24 h (Fig. 3b1) y (Video complementario 1). La condición de control sin células meníngeas se muestra en la Fig. 3b2. Las observaciones visuales durante 12 días demostraron claramente que las hCO en presencia de células meníngeas, a las que llamamos "hCOM", mostraron una forma esferoidal más definida y redondeada en comparación con las hCO (Fig. 3d) y (Fig. S5 complementaria). Además, la comparación de las dos condiciones con el monitoreo en tiempo real de los organoides individuales ilustró que se liberaron más desechos desde el borde de los organoides hacia el medio en hCO frente a hCOM (flechas rojas, figura 3b2). Los desechos se lavaron cambiando los medios. Además, un análisis de cuantificación adicional con el software IncuCyte Zoom ilustró que el tamaño del organoide durante 21 días aumentó notablemente (> cambio de 1,5 veces) en los hCOM en comparación con los hCO de control (Fig. 3c). Los datos se analizaron de cuatro experimentos separados y un número total de 18 organoides para la línea celular CC1 y los resultados se replicaron con el uso de dos líneas celulares adicionales (PCDH19 y CHD2) en la Fig. S6 complementaria. Juntos, estos resultados muestran que nuestro novedoso sistema de cocultivo que usa iPSC humanas y células meníngeas juntas puede mejorar de manera eficiente la morfología y el fenotipo de la formación de organoides corticales y aumentar su crecimiento en un curso de tiempo específico.

Sistema de cocultivo 3D para la generación de organoide de cerebro humano. (a) El esquema ilustra los pasos principales de la generación de organoides corticales humanos (hCO) a partir de iPSC y cocultivados con células meníngeas a partir del día 9. (b1,b2) Imágenes representativas del crecimiento de organoides en IncuCyte Zoom que muestran 6 imágenes el día de cocultivo (día 9) y más imágenes el día 18 y el día 21, así como imágenes representativas de hCO sin células meníngeas. ( c ) El crecimiento de tamaño de organoide utilizando el software de cuantificación IncuCyte Zoom ilustró una diferencia notable en el crecimiento de organoide entre los días 5 y 23. (d) Imagen representativa para mostrar la morfología de hCOM frente a hCO utilizando un microscopio de campo claro, barra de escala de 400 µm (n = 4 réplicas biológicas en total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 y n = 1 CHD2, n = 12 números se analizaron los organoides). Las flechas rojas identifican los desechos que se eliminan durante el cambio de medios. La barra de escala es de 400 µm para imágenes de campo claro.

Para comparar aún más los organoides corticales en hCO frente a hCOM, realizamos un análisis de expresión de marcadores para diferentes subtipos neuronales en diferentes momentos. Al final de las semanas 6 y 10, observamos que más neuronas expresaron el marcador de neuronas corticales de capa profunda CTIP2 en un área más expandida en hCOM en comparación con hCO (Fig. 3a) y las mediciones de cuantificación ilustraron que esta diferencia fue significativa después de 10 semanas (Fig. 4b). Al final de la semana 6, también observamos estructuras similares a VZ bien definidas con NPC PAX6 empaquetados cerca de la luz y IPC TBR2 formados por encima de la VZ, que recuerdan a la placa previa (PP) en el desarrollo cortical humano tanto en hCO como en hCOM. . Sin embargo, los IPC TBR2 se expandieron significativamente más en hCOM (P <0.005) (Fig. 4). Se ha demostrado que BRN2 tiene funciones cruciales en el posicionamiento de las neuronas neocorticales35 y es un marcador de las neuronas externas de la capa III. Después de observar la expansión mejorada de las células progenitoras basales en la región SVZ, evaluamos aún más la ampliación de las neuronas que expresan BRN2 y descubrimos que se expandió significativamente en las hCOM en comparación con las hCO. (p < 0,005) (Fig. 4e,f). Las imágenes alejadas de cada figura se muestran en las figuras complementarias S2 y S3. Juntos, nuestros datos revelan que los organoides corticales cultivados en nuestro novedoso sistema de cocultivo 3D ilustraron una laminación cortical bien definida.

El sistema de cocultivo resultó en un mejor desarrollo de la corticogénesis, (a) inmunotinción para el marcador de capa inferior CTIP2 y el marcador de capa superior SATB2 en hCOM versus hCO después de 6 semanas y 10 semanas. ( b ) Grosor relativo de la placa cortical (CP) en la semana 6 y la semana 10 en hCO y hCOM. Para cada estructura cortical, se tomaron tres medidas en ángulos de 45° para obtener el valor medio. El grosor relativo de CP es la relación entre el grosor de CP y el grosor total desde la superficie ventricular hasta la superficie pial. El grosor de CP se expandió de manera estadísticamente significativa después de 10 semanas en hCOM en comparación con hCO, p <0,05. Barras de error ± SD, todas las barras de escala: 100 µm, (c) los organoides corticales inmunoteñidos para PAX6 y el marcador IPC TBR2 mostraron un área SVZ comparativamente expandida en hCOM frente a hCO, y (d) la cuantificación estadística de la expresión de TBR2 mostró una diferencia significativa en hCOM frente a hCO en W6 (P < 0,005). ( e ) Los organoides corticales inmunoteñidos para el marcador de capa superior BRN2 mostraron un área expandida y más definida en hCOM versus hCO. ( f ) La cuantificación estadística de la expresión de BRN2 mostró una diferencia significativa en hCOM frente a hCO en W10 (n = 4 réplicas biológicas en total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 y n = 1 CHD2, n = 12 número de organoides analizados ). Barras de error ± SD. Barra de escala, 100 µm.

Realizamos más ensayos de inmunotinción para explorar otros marcadores neuronales para otras capas. HOPX, un marcador para la capa glial radial externa (oSVZ), estaba más expandido en hCOM en comparación con hCO (Fig. 5a). El análisis de imágenes mostró que este aumento fue significativo (Fig. 5b). En el día 70, observamos un área ampliada de expresión de REELIN en la zona marginal (MZ) en hCOM frente a hCO. REELIN está presente en la ZM cortical y es secretado por las neuronas de Cajal-Retzius. REELIN es el componente clave en la evolución de la organización radial de la placa cortical36 y se ha demostrado que la interrupción de la expresión de REELIN afecta la organización laminar adecuada de la neocorteza37. En el día 70, observamos que el grosor de la capa que expresa REELIN mejoró notablemente en hCOM en comparación con hCO (Fig. 5c). Para caracterizar esta expansión, medimos el grosor de la capa de Reelin tanto en hCO como en hOM y los datos demostraron una mejora de casi el doble de la zona marginal en el sistema de cocultivo (Fig. 5d). Las figuras representativas alejadas se muestran en la figura complementaria S3.

Organización y expresión de marcadores de diferentes zonas progenitoras, (a,b) Imágenes de muestra de inmunotinción de marcadores oRGC HOPX después de 10 semanas en hCOM y hCO y la cuantificación del grosor relativo del área de oSVZ en la semana 10 ilustra un aumento significativo en hCOM en comparación con hCO (p < 0005) (n > 10 estructuras corticales de 4 experimentos independientes). Barras de error ± SD, todas las barras de escala: 100 µm, (c, d) imágenes de inmunotinción representativas para el marcador de Cajal-Retzius preplaca REELIN después de 10 semanas en hCOM y hCO y cuantificación del grosor relativo del área MZ en la semana 10. Para cada estructura cortical, se tomaron tres medidas en ángulos de 45° para obtener la media. El grosor de MZ se expandió de manera estadísticamente significativa después de 10 semanas en hCOM en comparación con hCO (p <0,0005) (n = 4 réplicas biológicas en total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 y n = 1 CHD2, n = 10 número de organoides fueron analizado). Barras de error ± SD, barras de escala: 100 µm.

A continuación, investigamos si las señales de señalización de las células meníngeas pueden afectar la mejora de la proliferación de NP humanas en la formación cortical en un sistema organoide cerebral 3D. La evidencia genética humana existente sugiere fuertemente que la señalización del factor de crecimiento, como FGF, regula la formación cortical humana. En el estudio actual, tanto los organoides humanos de control como los de cocultivo contenían neuroepitelio organizado de una manera estereotipada que recuerda a la corteza en desarrollo temprano, donde las NP Ki67+ proliferaron en la superficie apical de la zona ventricular. En comparación con los controles, los hCOM albergaron más células Ki67+ en la semana 10 en comparación con la semana 8, donde en la condición de control disminuyeron con el tiempo desde la semana 8 a la 10 (figura complementaria S7). La proliferación mejorada fue prolongada y más prominente en la semana 8 a 10 en hCOM, sin embargo, en hCO de control, disminuyó con el tiempo. La corteza en desarrollo de humanos y otros mamíferos gyrencephalic albergan una VZ y SVZ más grandes, que están compuestas de células gliales sustancialmente más radiales y progenitores intermedios43. Por lo tanto, la mayor proliferación de IPC en nuestro sistema de cocultivo sugiere un mejor modelo in vitro de humanos. corticogénesis con capacidad de expansión mejorada que recapitula mejor el cerebro cortical humano; sin embargo, según los datos de cuantificación, la diferencia en la expresión de Ki67+ entre hCO y hCOM no fue significativa.

Luego preguntamos cómo nuestro sistema de cocultivo afecta la diferenciación de astrocitos. Los astrocitos comprenden el tipo de célula más numeroso en el cerebro de los mamíferos y se ha demostrado que tienen funciones importantes en el SNC, como el reciclaje de neurotransmisores44, el control de la formación de sinapsis45 y la función46. Los estudios también han demostrado que las meninges son fuentes importantes de factores inductores de astrocitos en el cerebro en desarrollo. Nuestros resultados de inmunotinción ilustraron la expresión de astrocitos en el día 56 y el día 70 tanto en hCO como en hCOM, que fue hasta cierto punto más en hCOM. (Figura complementaria S8).

La capacidad de las hiPSC para generar construcciones similares al cerebro en 3D nos permite desarrollar una nueva plataforma de modelado neurológico personalizado e investigar los mecanismos subyacentes al desarrollo y la enfermedad del cerebro humano. A pesar de las tecnologías avanzadas actuales en el desarrollo de organoides cerebrales, aún quedan muchos desafíos técnicos. En este estudio, establecimos un método eficiente basado en la formación de una sola roseta a partir de iPSC que puede alcanzar alrededor de 250 µm después de 5 días. En solo cinco días, estas estructuras en roseta mostraron una citoarquitectura en forma de tubo en la región apical que expresaba PKC-Z y N-CADHERINA y marcadores neurales progenitores PAX6 y NESTIN en la región basal. Nuestros resultados mostraron que estos organoides expresan marcadores neurales y del cerebro anterior después de 21 días. Además, nuestro análisis de inmunotinción en diferentes cursos de tiempo podría recapitular de manera eficiente la organización histológica y el patrón de expresión de los marcadores de desarrollo clave dentro de la corteza humana en desarrollo.

Es importante tener en cuenta que la mayoría de los métodos experimentales en la literatura comienzan la fabricación de organoides generando múltiples rosetas desde el principio donde cada una actúa como un centro de morfogénesis independiente4,5,47. Recientemente se ha prestado mayor atención a la creación de rosetas individuales48,49. Los protocolos basados en una sola roseta implican aislar y cultivar manualmente rosetas neurales bien formadas, que se inducen utilizando factores de crecimiento y otras moléculas de señalización. Este enfoque permite una formación de organoides más consistente y reproducible, lo que da como resultado organoides más homogéneos y definidos que imitan mejor los aspectos del desarrollo temprano del cerebro. Sin embargo, este enfoque requiere más mano de obra y es menos escalable. Por el contrario, otras técnicas, como los protocolos basados en cuerpos embrioides, implican permitir que las células madre pluripotentes se agreguen en estructuras tridimensionales sin manipulación manual. Este enfoque es más simple y requiere menos mano de obra, lo que permite la generación de un gran número de organoides para estudios de alto rendimiento, pero da como resultado organoides más variables.50,51. Aquí mostramos que nuestro método de formación de organoides puede formar rosetas individuales con menor variabilidad de tamaño en experimentos repetidos y aumentar la consistencia en la morfología y el fenotipo de los organoides del cerebro anterior 250 ± 20 μm. Sin embargo, es importante tener en cuenta que aunque nuestro método se basa en la formación de una sola roseta en la primera etapa de diferenciación, la disección de organoides en el día 42 ilustró múltiples VZ que muestran que a medida que maduran las hCO, se pueden observar más VZ (Fig. 9).

Desarrollamos aún más nuestro método con un sistema de cocultivo 3D que utiliza células meníngeas y ensamblamos hCOM derivados de iPSC para evaluar el efecto del cocultivo con células meníngeas en la morfología y el fenotipo de los organoides cerebrales corticales. Numerosos estudios han demostrado el papel crucial de las meninges como fuente de varios factores tróficos, incluidos FGF215, factor de crecimiento similar a la insulina17,52, CXCR1219 y ácido retinoico22,23. Teniendo en cuenta que estudios anteriores han demostrado claramente el papel crucial de las meninges en el desarrollo de neuronas, la producción de progenitores intermedios y el alargamiento del neuroepitelio22, queríamos aprovechar las células meníngeas en nuestro cultivo de organoides para determinar si podemos mejorar la corticogénesis y la formación de estructuras cerebrales. De hecho, observamos que la presencia de células meníngeas, y quizás los factores de señalización de estas células, ha mejorado significativamente la diferenciación y maduración de rosetas individuales y ha mejorado la morfología y el fenotipo cortical de nuestros organoides del cerebro anterior. Estudios in vivo han demostrado que las meninges secretan SDF1 que guía la migración tangencial de las células de Cajal-Retzius y las interneuronas corticales a lo largo de la zona marginal cortical, asegurando su correcta distribución durante la corticogénesis42,53. En nuestro sistema de cocultivo in vitro, observamos áreas marginales significativamente más grandes y claramente definidas que muestran una mayor expresión de REELIN, lo que sugiere que la secreción de factores de las células meníngeas generó una zona marginal mejor definida y, por lo tanto, mejoró la corticogénesis. También observamos áreas expandidas de IPC TBR2, marcador de capa profunda CITIP2 y marcador de capa superior BRN2. Además, la capa oSVZ, que es la característica principal de un organoide cortical humano y lo separa de los roedores, se expandió mucho y se definió bien en nuestro sistema de cocultivo. Además, observamos una maduración más temprana de los astrocitos en nuestro sistema y esto es consistente con estudios previos que mostraron que las meninges son fuentes importantes de factores inductores de astrocitos en el cerebro en desarrollo54. Es importante mencionar que, durante la generación de organoides entre los días 9 y 11, los organoides se expusieron a 1% de FBS. Los estudios han demostrado que FBS puede reactivar y aumentar la expresión de GFAP55. Sin embargo, considerando el hecho de que los primeros astrocitos se diferenciarán alrededor del día 40, que es aproximadamente 15 cambios completos en el medio después de la exposición al 1% de FBS, esto podría sugerir que los astrocitos maduros observados en el día 70 probablemente se generaron como consecuencia del efecto del medio. Sin embargo, se necesitaron más experimentos para averiguar si se observó una mayor expresión de GFAP debido a la presencia de FBS en el medio o si se expresó como resultado de una mayor diferenciación y maduración. Además, sería más informativo para futuros estudios utilizar otros marcadores de astrocitos como la glutamina sintetasa, BLBP (proteína de unión a lípidos cerebrales), S100β y vimentina y CD49f. Además, idealmente, se recomienda derivar células meníngeas de las mismas líneas de células madre pluripotentes (PSC) utilizadas para generar organoides corticales para mantener la compatibilidad genética y epigenética necesaria para la diferenciación y el desarrollo adecuados. Sin embargo, nuestro laboratorio de investigación no se centró en diferenciar las células meníngeas de las iPSC y no se consideró en nuestro estudio. También es importante considerar los posibles efectos a largo plazo del cocultivo meníngeo en el desarrollo de hCO, que podrían incluir alteraciones en la expresión génica, la proliferación celular y la diferenciación. Estos efectos pueden influir en el desarrollo y la maduración de las hCO y su capacidad para modelar con precisión los trastornos neurológicos. Sin embargo, se necesita más investigación para determinar los efectos específicos a largo plazo del cocultivo meníngeo en el desarrollo de hCO. El análisis de las propiedades funcionales de las hCO encapsuladas en meníngeas, incluida su capacidad para generar actividad eléctrica y responder a estímulos externos, podría proporcionar información valiosa para comprender su potencial como modelos para el estudio de trastornos neurológicos y el descubrimiento de fármacos. Los registros electrofisiológicos y las imágenes de calcio son métodos potenciales para la caracterización funcional de las hCO. Estos enfoques serán considerados en nuestros estudios futuros.

Nuestro sistema de cocultivo ha mejorado notablemente la arquitectura laminar de los organoides de roseta y ha permitido mejores comparaciones de organoides con tejido humano nativo. Las células meníngeas juegan un papel crucial en el desarrollo del cerebro in vivo, incluso en la formación y maduración de la neocorteza. En el caso de los hCOM, la inclusión de células meníngeas en el sistema de cocultivo 3D puede crear un entorno fisiológicamente más relevante que recapitule mejor la condición in vivo. Las células meníngeas secretan factores de crecimiento y citoquinas que regulan el desarrollo neural, la proliferación y diferenciación celular, lo que puede promover el desarrollo de ciertos subtipos neuronales y sus niveles de expresión en hCOMs50,56. Esto puede explicar por qué los hCOM mostraron niveles de expresión más altos de ciertos marcadores de subtipos neuronales en comparación con los hCO. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender completamente el papel de las células meníngeas en el desarrollo de organoides corticales. Estudios recientes han demostrado que la señalización de mTOR puede regular la arquitectura de la corteza humana en desarrollo al mantener la organización del citoesqueleto de las células ORG y el andamio de la glía radial53. Por lo tanto, nuestro sistema de cocultivo que tiene una capa mejor definida y mejorada de oRG ofrece un mejor modelo in vitro para recapitular la condición in vivo y una citoarquitectura y laminación mejoradas del cerebro en desarrollo.

Además, los estudios futuros podrían considerar agregar un tipo de célula adicional, como las células endoteliales, en combinación con las células meníngeas para permitir la vascularización de los organoides cerebrales. En la ingeniería de tejidos, la generación de organoides vascularizados es crucial para su crecimiento sostenido y para imitar el complejo microambiente in vivo. Los organoides derivados de células madre pluripotentes carecen de vasculatura, y las estrategias actuales para la vascularización de organoides no replican completamente el desarrollo conjunto in vivo. Para hacer frente a este desafío, los investigadores desarrollaron un chip microfluídico impreso en 3D para cocultivar organoides derivados de células madre pluripotentes humanas con células vasculares de una manera espacialmente determinada. Los pericitos y las células endoteliales en el chip se autoensamblaron en redes vasculares organizadas y se integraron con organoides cerebrales, formando un organoide neurovascular integrado57,58. Además, los canales de microfluidos hechos de materiales degradables podrían mejorar aún más la angiogénesis organoide e imitar mejor el microambiente in vivo59. Esto proporcionará una mejor plataforma para modelar una variedad de trastornos neurológicos, particularmente trastornos del neurodesarrollo que implican anomalías en el desarrollo cortical, como el trastorno del espectro autista (TEA), el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), discapacidad intelectual (DI), retraso en el desarrollo, esquizofrenia y epilepsia, y futuras aplicaciones terapéuticas. Al recapitular las complejas interacciones celulares que ocurren durante el desarrollo cortical, estos modelos podrían proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de estos trastornos y podrían ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Todos los datos relevantes están incluidos en el manuscrito. Los materiales, datos y protocolos descritos en el documento están disponibles previa solicitud razonable al autor correspondiente.

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También me gustaría agradecer al Departamento de Neurología de la Universidad de Michigan por brindarme las instalaciones para implementar los experimentos. Quisiera agradecer al Dr. Kamran Avanaki del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Illinois en Chicago por sus valiosas recomendaciones en la revisión del manuscrito.

Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, Institutos Nacionales de Salud, bajo la subvención KL2TR002002.

Departamento de Neurología, Centro Médico de la Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

Elmira Galilián

División de Ingeniería en Medicina, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de Harvard, Hospital Brigham and Women's, Cambridge, MA, 02139, EE. UU.

Su Ryon-Shin

Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales, Universidad de Illinois en Chicago, Chicago, IL, 60612, EE. UU.

Elmira Galilián

Richard y Loan Hill Departamento de Bioingeniería, Universidad de Illinois en Chicago, Chicago, IL, 60607, EE. UU.

Elmira Galilián

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EJ diseñó, supervisó, llevó a cabo toda la parte de los estudios y escribió el manuscrito. SRS brindó apoyo científico, leyó y aceptó la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Elmira Jalilian.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Jalilian, E., Shin, SR Nuevo modelo de sistema de cultivo conjunto de organoides corticales-meníngeos mejora la citoarquitectura de organoides del cerebro cortical humano. Informe científico 13, 7809 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

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Recibido: 23 enero 2023

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 14 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

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