Plata

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19866 (2022) Citar este artículo

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La troponina I cardíaca (cTnI) es un biomarcador cardíaco específico para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM). Todavía se requiere una prueba de punto de atención (POCT) sensible y simple para la detección temprana de IAM. Para abordar esta necesidad, desarrollamos un ensayo de tiras reactivas basado en un inmunoensayo tipo sándwich junto con un sistema de mejora de plata. Se introdujeron preincubación y aumento de plata en la tira de inmersión para aumentar la sensibilidad. Debido a la reacción catalítica de la solución de mejora de plata, el color rojo de las AuNP cambió a marrón oscuro a medida que los iones de plata precipitaron y agrandaron las AuNP. Los resultados obtenidos se observaron fácilmente a simple vista. Para el análisis cuantitativo, la intensidad del color de los resultados se analizó utilizando un teléfono inteligente con una aplicación de selección de color RGB. Se investigaron y optimizaron los efectos de los parámetros operativos (volumen de conjugado AuNP-Ab, volumen de muestra, tiempo de incubación y tiempo de análisis). En condiciones óptimas, el límite de detección (LOD) a simple vista fue de 0,5 ng/mL. El LOD con realce de plata fue 50 veces menor que sin él. Para el análisis cuantitativo con el teléfono inteligente, la linealidad de la detección se observó en el rango de 0,5 a 50 ng/mL (R2 = 0,9952) y el LOD fue de 0,12 ng/mL. El método desarrollado se aplicó con éxito a la detección de cTnI en muestras de suero, logrando recuperaciones analíticas y % RSD en los rangos de 96,10–119,17 % y 2,91–5,13 %, respectivamente. Además, este ensayo desarrollado no mostró reactividad cruzada con las proteínas séricas potencialmente interferentes. Estos resultados mostraron el gran potencial de este ensayo de tira de inmersión como POCT alternativo para la detección de cTnI en suero.

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son un grupo de trastornos del corazón y de los vasos sanguíneos. El número y la mortalidad de los pacientes con ECV han aumentado cada año y se espera que esta tendencia continúe en el futuro1,2. Un bloqueo de las arterias coronarias da como resultado una reducción del flujo sanguíneo y un suministro insuficiente de sangre al músculo cardíaco, lo que provoca su daño. El músculo cardíaco dañado se deteriorará y eventualmente se necrosará y morirá. Este tipo de daño cardíaco se conoce como infarto de miocardio (IM). Cuando el corazón está dañado, los biomarcadores cardíacos, como la mioglobina, la banda miocárdica de creatina quinasa (CK-MB), la troponina T cardíaca (cTnT) y la troponina cardíaca I (cTnI), se liberan en la circulación sanguínea3. Actualmente, la cTnI se considera el biomarcador cardíaco más específico y el estándar de oro para el diagnóstico de infarto de miocardio debido a su isoforma cardíaca única4,5. La cTnI es una proteína ubicada entre los filamentos de actina del tejido del músculo cardíaco normal. Tras el inicio del dolor torácico, los fragmentos de troponina cardíaca se elevan en la circulación sanguínea en un plazo de 4 a 9 h, siendo la forma predominante el complejo cTnC-cTnI6. Su concentración continúa aumentando hasta alcanzar un pico 12 a 24 h más tarde y permanece elevada hasta por 10 a 14 días. La magnitud de la elevación de la troponina cardíaca está asociada con la gravedad o el tamaño de la lesión cardíaca7,8. En consecuencia, la medición del nivel de cTnI es parte de una evaluación de riesgo clínico que permite el diagnóstico, pronóstico y seguimiento tempranos del infarto agudo de miocardio (IAM) con un nivel de cTnI de 0,4 ng/mL o más considerado indicativo de un IAM9,10,11.

Actualmente, el método convencional para la medición de biomarcadores cardíacos es el inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA)12,13,14. Aunque el método proporciona una alta sensibilidad y especificidad, requiere un gran sistema de detección de sobremesa y operadores expertos. Además, los instrumentos son muy costosos y tienen altos costos operativos. Alternativamente, los dispositivos POCT son herramientas portátiles que ayudan al personal médico a brindar atención inmediata a los pacientes. Los inmunoensayos de flujo lateral (LFIA) son posibles herramientas de detección que se utilizan como POCT. Esto se debe a que son rentables y son pruebas sencillas que se pueden utilizar con una formación mínima. En los últimos años, se informaron LFIA para la medición de la troponina I cardíaca utilizando varios marcadores de señal, como nanopartículas duales de oro15, microesferas fluorescentes16, puntos cuánticos17, partículas magnéticas18,19,20, etiquetado catalizado por enzimas21,22, nanopartículas de conversión ascendente23,24 y nanopartículas dopadas con iones25. Sin embargo, estos ensayos tienen sus propias limitaciones. Por ejemplo, las partículas fluorescentes requieren un lector de fluorescencia y hay que preocuparse por la fotoestabilidad y el rendimiento cuántico. Para el marcaje catalizado por enzimas, los informes describen las interacciones entre la enzima y el sustrato, y su análisis utilizando detectores quimioluminométricos. Estas técnicas se complican por los lectores de sensores asociados, que requieren altos gastos de operación y materiales. Además, los procesos para el marcaje de señales de anticuerpos son engorrosos.

Las nanopartículas de oro coloidal (AuNP) han sido ampliamente utilizadas como etiquetas con anticuerpos para inmunoensayos colorimétricos debido a su biocompatibilidad, simplicidad de síntesis, estabilidad, precisión y propiedades ópticas de alto rendimiento26. Sin embargo, normalmente están limitados por una baja sensibilidad de detección. Varios grupos han empleado la amplificación de la señal, incluida la mejora con plata, para mejorar la sensibilidad de estos inmunoensayos basados en AuNP27,28,29. Este método utiliza la reducción catalítica de iones de plata y los AuNP actúan como núcleos, lo que lleva a la precipitación de iones de plata en las superficies de AuNP. El gran tamaño de partícula de las AuNP proporciona el color oscuro e incluso aumenta su intensidad. Esto los hace más visibles, lo que permite leer los resultados a simple vista. Se ha propuesto un chip de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) con mejora de plata para la detección colorimétrica de cTnI28. Sin embargo, la fabricación de un chip de este tipo es un procedimiento complicado y el PDMS se deforma fácilmente, lo que a veces conduce a una colocación imprecisa del patrón. Además, la tinción con inmunooro y plata para mejorar la sensibilidad para la detección de cTnI utiliza placas de 96 pocillos, un proceso que requiere personal capacitado y requiere mucho tiempo29. En este trabajo, se introdujo el método de mejora de plata para aumentar la sensibilidad en el ensayo de tira de inmersión.

Recientemente, los dispositivos POCT se han integrado con ensayos colorimétricos para una detección simple y rápida30,31. Sus resultados se pueden interpretar fácilmente utilizando una cámara digital con una función de procesamiento de imágenes para cuantificar la intensidad del color de los resultados en relación con la concentración de analito. En la actualidad, los teléfonos inteligentes equipados con cámaras digitales han comenzado a utilizarse como herramientas de análisis de datos. Con el software adecuado, se han utilizado para la detección y cuantificación de medidas colorimétricas. Algunos teléfonos inteligentes se establecen como detectores analíticos portátiles debido a su simplicidad, portabilidad y bajo costo en comparación con los instrumentos comerciales32. Por lo tanto, el uso de un teléfono inteligente es una opción alternativa para la medición cuantitativa.

En este estudio, se desarrolló una tira de inmersión basada en AuNP que utiliza un inmunoensayo sándwich junto con una mejora de plata para su uso como dispositivo POCT, lo que proporciona un ensayo simple y sensible que elimina la necesidad de equipos complicados y costosos. Mediante este ensayo, los resultados positivos fueron de color marrón oscuro y podían observarse fácilmente a simple vista. La sensibilidad de detección mejoró 50 veces en comparación con la prueba sin realce de plata. Además, la colorimetría basada en teléfonos inteligentes se integró en el sistema para una medición cuantitativa simple de cTnI. El dispositivo desarrollado se aplicó con éxito para la determinación de cTnI en muestras de suero con buena precisión y confiabilidad.

Para conjugar las AuNP con el anticuerpo, se investigaron los efectos de la concentración del anticuerpo contra la troponina I cardiaca (anti-cTnI) y el pH de la solución de las AuNP. La concentración óptima de anticuerpo anti-cTnI para la conjugación con AuNP se determinó en función de los resultados con una serie de concentraciones (0, 10, 50, 75, 100, 150, 175 y 200 µg/mL). Posteriormente, se añadió NaCl al 10 % a la mezcla que contenía anticuerpo anti-cTnI y AuNP. Los resultados se muestran en la figura 1a. Tras la adición de NaCl, se indujo la agregación de AuNP, lo que resultó en un cambio de color de AuNP de rojo a azul. A bajas concentraciones de anticuerpo anti-cTnI, el color de las AuNP era violeta o rojo violeta debido al exceso de AuNP libres. Mientras que no hubo cambio de color de las suspensiones de AuNP a las altas concentraciones de anticuerpo anti-cTnI debido a la unión suficiente del anticuerpo. Los espectros UV-visible de AuNP (Fig. 1b) mostraron que la absorbancia (λmax = 520 nm) aumentó con el aumento de la concentración de anticuerpos anti-cTnI y alcanzó una meseta a 175 µg/mL. Por lo tanto, se seleccionó 175 µg/mL de anticuerpo anti-cTnI como la concentración a utilizar en el siguiente experimento.

( a ) Los resultados de las soluciones de AuNP con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-cTnI después de agregar NaCl al 10%. (b) Gráfica de absorbancia observada a 520 nm frente a la concentración de anticuerpo anti-cTnI. (c) Representación gráfica de las proporciones de absorbancia de AuNP a través del pH después de agregar NaCl al 10 % con una concentración fija de anticuerpo anti-cTnI de 175 µg/mL.

Dado que el pH afecta la estabilidad y la actividad de unión de AuNP-Ab, se estudió ajustando los valores de pH de 5 a 9. La estabilidad y la polidispersidad de la solución coloidal se determinaron calculando la relación de absorbancia en λmax/580 nm y 600 nm/λmax. (λmax = 520 nm), respectivamente27. Los resultados (Fig. 1c) mostraron que la mayor estabilidad y la menor polidispersión ocurrieron a pH 7. Por lo tanto, se eligió este pH óptimo para la preparación posterior de AuNP conjugados con anticuerpos anti-cTnI.

Para caracterizar las AuNP conjugadas con anticuerpos anti-cTnI, se usaron espectros UV-visibles e imágenes TEM para comparar las AuNP desnudas y conjugadas con Ab. Como se muestra en la Fig. 2a, las AuNP no conjugadas poseían un espectro de extinción de plasmones superficiales con un pico máximo a 520 nm. Después de la conjugación de AuNP con anticuerpo anti-cTnI, los espectros UV-vis mostraron un espectro de absorción ligeramente mayor con el pico ligeramente desplazado (a 530 nm). Este cambio espectral fue causado por un cambio en la resonancia de plasmón de superficie localizada afectada por la capa de adhesión de proteína. Además, las imágenes TEM (Fig. 2b) mostraron que el diámetro promedio de AuNP era de 20 nm. Después de la absorción física del anticuerpo en AuNP, el diámetro promedio aumentó a 25 nm. Estos resultados indicaron una conjugación exitosa del anticuerpo anti-cTnI en las AuNP33,34.

( a ) Espectros de extinción de plasmones superficiales (por espectros UV-visible) de AuNP desnudos y conjugados con Ab. ( b ) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de ( i ) AuNP y ( ii ) AuNP conjugadas con Ab.

Para obtener la detección altamente sensible de cTnI necesaria para el diagnóstico de IAM, se desarrolló una tira reactiva basada en un inmunoensayo tipo sándwich con pasos de preincubación y mejora de la señal, junto con una aplicación de detección colorimétrica basada en teléfonos inteligentes (Fig. 3b). En este ensayo desarrollado se introdujo la incubación previa del conjugado de AuNP-Ab con la muestra para completar la unión del conjugado de AuNP-Ab con cTnI. Se ha demostrado que este procedimiento aumenta la sensibilidad, la reproducibilidad y la precisión de la prueba35. Después de colocar la tira de inmersión en la mezcla de conjugado AuNP-Ab y muestra que contenía cTnI, el conjugado cTnI-AuNP-Ab migró a través de una membrana de nitrocelulosa por acción capilar.

( a ) Ilustración esquemática de la tira de inmersión basada en inmunoensayo de sándwich. (b) Diagrama esquemático del procedimiento de la tira de inmersión. ( c ) Esquema de la reacción de mejora de plata que muestra el cambio de color de AuNP.

En presencia de cTnI, el anticuerpo anti-cTnI inmovilizado se unió específicamente al conjugado cTnI-AuNP-Ab en la línea de prueba. Mientras tanto, el conjugado AuNP-Ab libre en exceso fluyó a la línea de control y reaccionó con el anticuerpo anti-ratón de cabra. Los resultados se observaron como un color rojo tanto en la línea de prueba como en la de control. Por otro lado, en ausencia de cTnI, los resultados mostraron el color rojo solo en la línea de control. Sin embargo, la detección con este método tuvo baja sensibilidad.

Para aumentar la sensibilidad, se aplicó una mejora de plata a la tira de inmersión basada en una reacción cromogénica catalizada por AuNP (Fig. 3c). Después de aplicar la mezcla de solución de nitrato de plata e hidroquinona a la tira de inmersión, la hidroquinona redujo los iones de plata para formar una capa en las AuNP. El color rojo de las AuNP cambió a un color marrón oscuro aparentemente debido a los iones de plata precipitados en las superficies de las AuNP. Los resultados positivos (en presencia de cTnI) mostraron un color marrón oscuro tanto en la línea de prueba como en la de control, mientras que los resultados negativos (en ausencia de cTnI) indicaron un color marrón oscuro solo en la línea de control. Los resultados de la prueba eran detectables y podían interpretarse semicuantitativamente a simple vista. Además, los resultados podrían cuantificarse usando la intensidad RGB por teléfono inteligente con una aplicación RGB.

Se investigaron los parámetros que podrían influir en la sensibilidad de la tira de inmersión. Estos incluyeron el volumen de AuNP conjugados con anticuerpos anti-cTnI, el volumen de la muestra, el tiempo de incubación y el tiempo de análisis. Para obtener resultados, la intensidad RGB en la línea de prueba después de la prueba con 250 ng/mL de cTnI seguido de la mejora de la señal se interpretó mediante un teléfono inteligente con una aplicación de selección de color RGB.

El efecto del volumen del conjugado de AuNP-Ab se optimizó agregando el conjugado de AuNP-Ab en volúmenes de 3, 5, 7 o 9 µL a muestras que contenían cTnI a 40 µL con una incubación posterior de 60 min. La intensidad RGB más alta (proporción B/T) se obtuvo cuando el volumen del conjugado AuNP-Ab fue de 7 µL (Fig. 4a). Por lo tanto, esta concentración de conjugado AuNP-Ab se usó para experimentos adicionales.

Optimización de varios parámetros que afectan el inmunoensayo de la tira de inmersión: (a) volumen del conjugado AuNP-Ab, (b) volumen de la muestra, (c) tiempo de incubación y (d) tiempo de análisis. Los puntos de datos representan la media de tres repeticiones (n = 3), barra de error.

Los volúmenes de muestra (40, 60 y 80 µL) se evaluaron comparativamente. Como se muestra en la Fig. 4b, la intensidad del color aumentó al aumentar el volumen de la muestra de 40 a 60 µL. La intensidad RGB más alta (proporción B/T) en la línea de prueba se mostró a 60 µL. Luego, la intensidad del color disminuyó a 80 µL. El 'efecto gancho' se producía cuando el volumen de la muestra superaba los 60 µL debido a la alta concentración de analito. En base a estos resultados, se seleccionó 60 µL como el volumen de muestra óptimo para la tira reactiva.

El efecto del tiempo de incubación sobre la unión antígeno-anticuerpo se examinó a temperatura ambiente durante 0, 15, 30, 45 y 60 min. Como se muestra en la Fig. 4c, la B/T de la intensidad RGB en la línea de prueba aumentó a medida que aumentaba el tiempo de incubación y alcanzó un estado de meseta a los 45 min. Esto indicó que la reacción entre el conjugado AuNP-Ab y cTnI se había completado. Por lo tanto, elegimos 45 min como el tiempo de incubación óptimo para el ensayo desarrollado, un tiempo más corto que el requerido por el kit ELISA comercial.

Una de las características más significativas de un ensayo de diagnóstico es el tiempo de análisis. En este ensayo, el potenciador de plata hizo que el color en la línea de prueba cambiara de rojo a marrón oscuro. El tiempo de análisis para la interpretación de los resultados se investigó durante 30 min (a los 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 min). La intensidad del color aumentó con el aumento del tiempo de análisis de 0 a 15 min (Fig. 4d). El B/T más alto de intensidad RGB en la línea de prueba se alcanzó a los 15 min y no aumentó más. Los resultados de la prueba en la tira fueron estables a los 15–30 min. Por lo tanto, se eligió 15 min como el tiempo de análisis óptimo para el procedimiento de la tira reactiva.

El rendimiento de la tira de inmersión desarrollada se analizó en las condiciones óptimas descritas anteriormente. Las muestras de suero que contenían cTnI se analizaron mediante electroquimioluminiscencia para determinar la concentración de cTnI. Los resultados se obtuvieron utilizando sueros enriquecidos con cTnI en concentraciones que oscilaban entre 0 y 250 ng/mL (Fig. 5a). La intensidad del color en la línea de prueba se controló antes y después de la mejora de la señal. El límite de detección (LOD) logrado a simple vista sin y con realce de plata fue de 25 y 0,5 ng/mL, respectivamente. Por lo tanto, la mejora de plata produjo un aumento de 50 veces en la sensibilidad de esta tira de prueba de cTnI desarrollada.

(a) Imágenes de cTnI detectadas en concentraciones de 0 a 250 ng/mL (i) antes y (ii) después de la mejora con plata. (b) Gráfica de intensidad RGB (relación B/T) versus concentración de cTnI interpretada por un teléfono inteligente con una aplicación de selector de color RGB. (c) Curva de calibración de la concentración de cTnI en el rango de 0 a 50 ng/mL. (d) Curva de calibración de la concentración de cTnI en el rango de 50 a 250 ng/mL.

Para la medición cuantitativa usando un teléfono inteligente, el resultado de interés fue la intensidad RGB (relación B/T) en la línea de prueba que se obtuvo usando una aplicación de selección de color RGB. Se representó la intensidad de RGB frente a la concentración de cTnI (Fig. 5b). Se encontró que las proporciones B/T de la intensidad RGB aumentan proporcionalmente con la concentración de cTnI. Sin embargo, cuando la concentración de cTnI alcanzó los 100 ng/ml, el aumento de la intensidad se hizo más lento y pareció estabilizarse en 250 ng/ml. Como se muestra en la figura 5c, hubo una buena relación lineal entre la intensidad de la señal y la concentración de cTnI en el rango de 0,5 a 50 ng/mL. La ecuación lineal y su correspondiente coeficiente de correlación fueron Y(Lineal) = 0,0113x + 1,0286 y R2 = 0,9952, respectivamente, donde Y es la intensidad RGB (relación B/T) en la línea de prueba y X es la concentración de cTnI. Las barras de error del RSD se derivan de tres mediciones independientes. El LOD calculado (3,3 DE/pendiente) resultó ser de 0,12 ng/mL, un valor inferior al nivel de corte de cTnI (0,4 ng/mL) utilizado para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM)9,10,11. Además, se pudieron obtener concentraciones más altas de cTnI (50–250 ng/mL) del gráfico de calibración en función de la línea de tendencia logarítmica (Fig. 5d). La ecuación logarítmica y su correspondiente coeficiente de correlación fueron Y(Logarítmico) = 1,4804ln(X) − 4,1308 y R2 = 0,9827, respectivamente. Dado que con el inicio del dolor torácico, el nivel de cTnI sérica aumenta en 4 h, alcanza su punto máximo en 12 a 24 h y permanece elevado hasta 10 a 14 días36, nuestro ensayo de tira reactiva desarrollado podría usarse potencialmente para el diagnóstico de IAM.

Se investigó la posible reactividad cruzada del ensayo desarrollado para evaluar su especificidad en presencia de sustancias potencialmente interferentes que se encuentran en el suero. Se realizaron pruebas con albúmina, bilirrubina y colesterol en niveles dentro de sus rangos normales para suero humano (4000 mg/dL de albúmina, 1 mg/dL de bilirrubina y 200 mg/dL de colesterol). Como se muestra en la Fig. 6, los resultados de la prueba demostraron que el color marrón oscuro apareció en la línea de prueba en presencia de 100 ng/ml de cTnI, pero no con ninguna de las otras sustancias analizadas. Además, no hay diferencias significativas en la intensidad del color de las muestras que contienen la línea de prueba de interferencia en comparación con el suero en blanco. Estos resultados indicaron que el inmunoensayo de tira de inmersión desarrollado mantuvo su especificidad hacia la determinación de cTnI a pesar de la presencia de albúmina, bilirrubina y colesterol. Por sustancia interferente, la hemoglobina puede causar interferencia si se presentó el suero hemolizado37,38. Por lo tanto, los resultados de la concentración de troponina I cardíaca deben interpretarse con precaución para el suero levemente hemolizado con un color rosa ligeramente detectable, mientras que el suero moderada o severamente hemolizado debe rechazarse.

Gráfico de barras e imágenes de la prueba de reactividad cruzada después del realce con plata, evaluando la intensidad del color de la relación B/T del blanco de suero, cTnI, albúmina, bilirrubina y colesterol.

Con el fin de validar la exactitud y precisión del inmunoensayo de tira de inmersión desarrollado para la determinación de cTnI, la tira de prueba desarrollada se utilizó para determinar cTnI en una muestra de suero. Los sueros se enriquecieron con proteína cTnI a concentraciones designadas de 3, 11, 27 y 80 ng/mL. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Las recuperaciones analíticas y el % RSD se lograron en los rangos de 96,10–119,17 % y 2,91–5,13 %, respectivamente. Este inmunoensayo de tira de inmersión desarrollado proporcionó una detección exacta y precisa de cTnI en muestras de suero.

Para la detección y cuantificación de cTnI, se desarrolló un inmunoensayo sándwich simple y sensible basado en tiras reactivas, junto con oro coloidal mejorado con plata. Se empleó un sistema de mejora de plata para la amplificación de la señal en AuNP de la tira de inmersión desarrollada. Los resultados se observaron fácilmente a simple vista (LOD 0,5 ng/mL). Además, se evaluó un teléfono inteligente con una aplicación de selector de color RGB debido a su simplicidad, bajo costo y enfoque innovador para la cuantificación de resultados. Utilizando interpretaciones basadas en la intensidad RGB, se encontró que el LOD era de 0,12 ng/mL con una buena correlación lineal (R2 = 0,9952) en el rango de 0,5 a 50 ng/mL. El ensayo desarrollado exhibió un potencial alentador para la detección de cTnI en suero humano. Mostró una especificidad sobresaliente para la detección de cTnI sin reactividad cruzada con proteínas plasmáticas importantes. En consecuencia, este enfoque de un ensayo alternativo para el análisis de cTnI en pacientes con sospecha de IAM es muy prometedor.

La inmunoglobulina G anti-ratón de cabra se obtuvo de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, EE. UU.). El anticuerpo monoclonal de troponina I cardíaca (4T21cc–19C7cc) y el anticuerpo monoclonal de troponina I cardíaca (4T21cc–560) se adquirieron de HyTest Ltd. (Turku, Finlandia). El complejo IC de troponina cardíaca se obtuvo de MyBioSource, Inc. (San Diego, CA, EE. UU.). Se adquirieron albúmina, bilirrubina, colesterol, trihidrato de cloruro de oro (III) (HAuCl4•3H2O), suero humano, solución salina tamponada con fosfato (PBS), nitrato de plata y Tween 20 de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió de Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Alemania). La hidroquinona se adquirió de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japón). El monohidrato de ácido cítrico y el dihidrato de citrato de sodio se obtuvieron de Bio Basic Inc. (Ontario, Canadá). En los experimentos se utilizaron todos los productos químicos y reactivos de grado analítico, y agua mill-Q (18 MΩ-cm).

Los AuNP (20 nm) se sintetizaron usando una ligera modificación de un procedimiento previamente informado39. En resumen, se hirvieron 100 ml de HAuCl4 al 0,01 % disueltos en agua milli-Q con agitación continua. Se agregaron dos mL de citrato trisódico al 1% y se agitó durante 5 min (hasta que apareció el color rojo), luego la solución se enfrió a temperatura ambiente con agitación continua. Finalmente, se obtuvieron 20 nm de AuNPs. La solución de AuNP se almacenó a 4 °C en una botella cubierta con papel de aluminio para su uso posterior. Los AuNP sintetizados se caracterizaron por espectrometría UV-visible usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) usando un microscopio electrónico JEM-2100 (JEOL Ltd., Tokio, Japón) como se muestra en la Fig. 2b (i).

Los AuNP conjugados con anticuerpo anti-cTnI se prepararon mezclando 100 µL de 175 µg/mL de anticuerpo anti-cTnI y 1 mL de AuNP de 20 nm a pH 7, seguido de incubación durante 1 h a temperatura ambiente con agitación continua. A continuación, se añadieron a la solución 100 µl de BSA al 5 % en PBS 10 mM, pH 7,4, para reducir la unión no específica de AuNP con otras moléculas. Tras una incubación de 1 h a temperatura ambiente, la mezcla se centrifugó a 12.000 rpm durante 45 min a 4 °C, con posterior eliminación del sobrenadante. A continuación, el sedimento se resuspendió en BSA al 5 % en PBS 10 mM, pH 7,4, hasta un volumen final de 100 µl. Esta solución de AuNP conjugada con anticuerpo anti-cTnI lista para usar se almacenó a 4 °C. Los AuNP conjugados con anticuerpos anti-cTnI se caracterizaron con el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y el microscopio electrónico JEM-2100 (JEOL Ltd., Tokio, Japón) como se muestra en la Fig. 2b (ii).

Para aumentar la sensibilidad de detección, en este estudio se utilizó un método de mejora de plata. La solución de mejora de plata se preparó recientemente mezclando 2 mg/ml de nitrato de plata con 5 mg/ml de hidroquinona en tampón de citrato pH 3,8 en una proporción de reactivo de 1:1 (V:V).

La tira de prueba desarrollada se componía de 3 partes, incluida una almohadilla de muestra (Whatman FUSION 5), una almohadilla de nitrocelulosa (Whatman AE99) y una almohadilla absorbente (Whatman CF7) que se pegaron secuencialmente en una tarjeta de respaldo de plástico (GE Healthcare, Pittsburgh, PA , EE. UU.) como se muestra en la Fig. 3a. Para preparar la tira reactiva para la detección de cTnI, se inmovilizaron 1 µL de 0,5 mg/mL de inmunoglobulina G de cabra anti-ratón y 1 µL de 1 mg/mL de anticuerpo anti-cTnI en la almohadilla de nitrocelulosa en las líneas de control y de prueba, respectivamente. . Finalmente, la tira reactiva preparada se secó durante 2 h. (La tira fabricada tenía una anchura de 4 mm). La tira de prueba lista para usar se selló y almacenó a 4 °C. Además, la tira reactiva se mantuvo estable durante un período de almacenamiento de al menos 3 meses.

El procedimiento de prueba de una tira de inmersión (basada en un inmunoensayo tipo sándwich) para la determinación de cTnI se muestra en la Fig. 3b. Se mezclaron sesenta µl de muestra de suero o estándar de cTnI con 7 µl de AuNP conjugados con anticuerpos (conjugado de AuNP-Ab) y se incubaron durante 45 min en el pocillo de la muestra. A continuación, la tira reactiva se sumergió en el pocillo. Después de 5 min, se añadieron 80 µl de un tampón de funcionamiento (Tween 20 al 0,1 % en PBS 10 mM, pH 7,4) para reducir el ruido de fondo. Posteriormente, se agregaron 80 µL de la solución de mejora de plata para completar el procedimiento. El resultado de la prueba se interpretó después de 15 minutos a simple vista y detección de teléfonos inteligentes. Un resultado negativo fue indicado por la presencia de solo una línea de control roja o marrón oscura antes y después de la mejora, respectivamente. En el caso de un resultado positivo, aparecían líneas tanto de prueba como de control, de color rojo/rosado y marrón oscuro, antes y después del realce, respectivamente. La intensidad del color en la línea de prueba varió directamente con la concentración de cTnI. La concentración de la muestra se pudo estimar a simple vista en comparación con el estándar de cTnI. Para el análisis cuantitativo se tomó una imagen de las líneas de prueba con un teléfono inteligente (Samsung S10) con modo automático y sin flash bajo una caja de luz de control. Los valores medios de intensidad rojo-verde-azul (RGB) se analizaron utilizando un teléfono inteligente con una aplicación de selección de color RGB. Luego, se calculó la relación intensidad de fondo por prueba (B/T) usando la ecuación: I (intensidad) = (R + G + B)/3. El valor obtenido se utilizó para obtener la concentración de cTnI con una curva de calibración.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación fue financiada por el Royal Golden Jubilee (RGJ) Ph.D. (Subvención No. PHD/0062/2561), a través del Fondo de Investigación de Tailandia (TRF) y el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia (NRCT). AA y OC agradecen el apoyo del proyecto de investigación del Consejo Nacional de Investigación de Tailandia (NRCT): N41A640073.

Departamento de Química Clínica, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Mahidol, 999 Phutthamonthon 4 Road, Salaya, Nakhon Pathom, 73170, Tailandia

Napakporn Poosinuntakul, Theerawut Chanmee, Sureerut Porntadavity y Amara Apilux

Centro de Excelencia de Electroquímica y Espectroscopía Óptica, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Tailandia

Orawon Chailapakul

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NP y AA conceptualizaron esta investigación; NP y AA diseñaron los experimentos; NP realizó los experimentos; NP y AA formal analizaron e interpretaron los datos; NP y AA prepararon metodología de investigación; NP redactó y escribió el manuscrito y preparó todas las figuras y tablas; NP, TC y AA investigaron el manuscrito; SP, OC y AA supervisaron esta investigación; TC, SP y AA validaron el manuscrito; TC, SP, OC y AA revisaron y editaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aceptaron la versión enviada del manuscrito.

Correspondencia a Amara Apilux.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Poosinuntakul, N., Chanmee, T., Porntadavity, S. et al. Inmunoensayo de tira de inmersión de oro coloidal mejorado con plata integrado con colorimetría basada en teléfonos inteligentes para la detección sensible del marcador cardíaco troponina I. Sci Rep 12, 19866 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24458-1

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Recibido: 31 agosto 2022

Aceptado: 15 de noviembre de 2022

Publicado: 18 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24458-1

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