Yijung

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 32 (2023) Citar este artículo

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Actualmente, se presta una atención considerable a explorar la posible relación entre la medicina herbaria (HM) y el microbioma intestinal en términos de termorregulación, que es un aspecto importante de la salud humana, en la biología de sistemas moderna. Sin embargo, nuestro conocimiento de los mecanismos de HM en la termorregulación es inadecuado. Aquí, demostramos que la fórmula herbal canónica, Yijung-tang (YJT), protege contra la hipotermia, la hiperinflamación y la disbiosis de la microbiota intestinal en ratas con hipotiroidismo inducido por PTU. En particular, estas propiedades se asociaron con alteraciones en la microbiota intestinal y señales cruzadas entre los mediadores termorreguladores e inflamatorios en el intestino delgado y el tejido adiposo marrón (BAT). A diferencia del fármaco convencional L-tiroxina para curar el hipotiroidismo, YJT tiene eficacia para atenuar las respuestas inflamatorias sistemáticas, relacionadas con la depresión en las vías de señalización intestinal TLR4 y Nod2/Pglyrp1. Nuestros hallazgos sugieren que YJT podría promover la termogénesis de BAT y prevenir la inflamación sistémica en ratas con hipotiroidismo inducido por PTU, lo que se asoció con su efecto prebiótico en la modulación de la microbiota intestinal y la expresión génica con relevancia en la función enteroendocrina y los sistemas inmunitarios innatos. Estos hallazgos pueden fortalecer la lógica del eje microbiota-intestino-BAT para un cambio de paradigma que permita la medicina centrada en holobiontes.

La termorregulación es una característica clave en el mantenimiento de la homeostasis que permite que los procesos de los órganos funcionen de manera efectiva, y su estrecha relación con las hormonas tiroideas está bien documentada1,2. Con un aumento de las enfermedades metabólicas en los últimos años, las disfunciones tiroideas, especialmente el hipotiroidismo, representan los trastornos endocrinos más comunes y son un problema de salud importante que afecta a ~4-10% de la población mundial3,4. El tratamiento convencional del hipotiroidismo genera eventos farmacológicos adversos, altos costos de tratamiento y problemas de cumplimiento, lo que lleva a los científicos a identificar posibles estrategias alternativas para el tratamiento de trastornos fisiológicos crónicos. En este contexto, la medicina herbal (HM), como la medicina tradicional china y coreana, ha sido ampliamente estudiada por su potencial en el tratamiento del hipotiroidismo, con base en una variedad de teorías únicas y experiencia clínica significativa5,6,7.

El hipotiroidismo exhibe una disminución del metabolismo energético y, por lo tanto, para su tratamiento se han utilizado fármacos con propiedades cálidas debido a sus impactos potenciales sobre el aumento del metabolismo energético5. Yijung-tang (YJT), también conocido como Li-Zhong-Tang, es una fórmula herbal china canónica con propiedades cálidas que se describió por primera vez en el Tratado sobre enfermedades febriles y misceláneas de Zhongjing Zhang hace 1800 años. Se utiliza con frecuencia para aliviar los síntomas del hipotiroidismo y presenta efectos antioxidantes e inmunomoduladores8. YJT comprende las siguientes hierbas: Zingiber officinale Rose (Familia: Zingiberaceae) rizoma (9 g), Atractylodes macrocephala Koidz (Familia: Asteraceae) rizoma (9 g), Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Familia: Campanulaceae) raíz (9 g), y Glycyrrhiza uralensis Fisch. Ej. CC. (Familia: Fabaceae) rizoma (9 g)8. Sin embargo, la farmacología y los mecanismos de sus propiedades cálidas aún no se han investigado.

Como factor crucial en la fisiología de los mamíferos, el microbioma se ha convertido en un campo de investigación novedoso que constituye una parte integral de la salud. Los recientes avances tecnológicos con el lanzamiento de varios proyectos internacionales sobre el microbioma intestinal humano han permitido un amplio estudio e investigación de puntos críticos entre las enfermedades crónicas y el microbioma intestinal relacionado con la salud humana9,10. Estudios previos identificaron la asociación entre el microbioma intestinal y la fisiopatología tiroidea, y demostraron cambios en la concentración de hormonas tiroideas por diferentes vías, incluida una alteración en la composición de las bacterias intestinales, así como el efecto sobre las yodotironina desyodasas (Dios)11,12. Además, se ha propuesto que el eje tiroides-intestino influye en todo el metabolismo mediante el reciclaje de las hormonas tiroideas13. Mientras tanto, como la microbiota intestinal es estructuralmente dinámica en el tiempo y plástica en diferentes condiciones, y dado que una de las características de HM es que puede administrarse por vía oral, HM interactuará inevitablemente con la flora intestinal y ayudará a mantener la homeostasis de la microbioma intestinal. Por lo tanto, el microbioma intestinal como canal puede ejercer efectos farmacológicos de HM en el huésped14,15. YJT contiene polisacáridos prebióticos que pueden estimular selectivamente el crecimiento y la actividad de bacterias beneficiosas en el intestino y, como fuente de alimento para estas bacterias, promover la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) para apoyar la salud intestinal y el bienestar general16,17. Esta evidencia nos llevó a la hipótesis de que YJZ podría regular la termogénesis y la inflamación mediante la reprogramación de la microbiota intestinal y múltiples vías de señalización para aliviar los síntomas del hipotiroidismo.

Al establecer el modelo de hipotiroidismo y realizar la secuenciación del gen 16 S rRNA, nuestro objetivo fue demostrar que YJT eleva la temperatura corporal (Tb), disminuye la inflamación sistémica y revierte la disbiosis de la microbiota intestinal asociada con el hipotiroidismo. Los síntomas de hipotiroidismo podrían inducirse en ratas de tipo salvaje con tratamiento antibiótico mediante una transferencia de microbiota cecal (CMT) de individuos hipotiroideos, y estos síntomas están ausentes en los receptores por CMT de hipotiroidismo tratado con YJT. Además, demostramos que YJT estimula la termogénesis del tejido adiposo marrón (BAT) y previene la inflamación sistémica mediante la reprogramación de la microbiota intestinal y las múltiples vías de señalización relacionadas.

Se probó si YJT podría mejorar la Tb y prevenir la inflamación sistémica en un modelo de rata con hipotiroidismo inducido por propiltiouracilo (PTU), con L-tiroxina (T4) como fármaco de referencia (Fig. 1a). El tratamiento con PTU redujo el aumento de la masa corporal (Fig. 1b) e indujo una reducción del 50 % en la ingesta de alimentos (Fig. 1c) y una disminución de > 1 °C en la Tb promedio (Fig. 1d, Figura complementaria 1a) en comparación con el control. Tanto YJT como T4 inhibieron la pérdida de masa corporal inducida por PTU, la ingesta de alimentos y la Tb aproximadamente 9 días después de la administración (Fig. 1b-d). Además, el tratamiento con YJT condujo a una recuperación de estos parámetros metabólicos, mientras que el tratamiento a largo plazo con T4 indujo hiperfagia e hipertermia. Tanto YJT como T4 recuperaron la tolerancia a la glucosa que fue interrumpida por PTU (Fig. 1e). Como se predijo, se detectó un aumento significativo en los niveles séricos de hormona estimulante de la tiroides (TSH) y disminuciones en los niveles de T4 y triyodotironina (T3) en ratas con hipotiroidismo inducido por PTU en comparación con los controles (Fig. 1f-h). YJT revirtió los niveles séricos de T4 y T3 a los niveles de control (Fig. 1f-h). Aunque PTU no afectó los niveles séricos de grelina (hormona anorexigénica, Fig. 1i), aumentó la secreción de péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) (una hormona anorexigénica, Fig. 1j), lo que resultó en una reducción de la ingesta de alimentos en ratas tratadas con PTU. Tanto el tratamiento con YJT como con T4 estimularon la secreción de grelina, y YJT, en lugar de T4, previno los aumentos inducidos por PTU de los niveles séricos de GLP-1 (Fig. 1i, j). Los marcadores inflamatorios circulantes, como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y los lipopolisacáridos (LPS), aumentaron tanto en los grupos tratados con PTU como en los tratados con T4 + PTU, mientras que YJT previno la inflamación sistémica inducida por PTU (Fig. 1k, l). Además, la histología del íleon indicó que el hipotiroidismo alteró la barrera intestinal y la absorción indicada por la disminución de la longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas, mientras que el tratamiento con YJT y T4 invirtió estas variables (Fig. 1m). El tratamiento con T4 provocó un aumento significativo en la longitud del intestino delgado y la masa de algunos órganos, incluidos el hígado, el corazón y el bazo (Figura complementaria 1b, c).

una descripción esquemática del diseño experimental; b masa corporal; c ingesta de alimentos; d temperatura corporal central promedio (Tb) durante el experimento (n = 5 por grupo). e El metabolismo de la glucosa se evaluó mediante una prueba de tolerancia oral a la glucosa. f–hLos niveles de hormona estimulante de la tiroides (TSH), tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). i–l Grelina sérica, péptido 1 similar al glucagón (GLP-1), factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y lipopolisacáridos (LPS). m Ensayo de histología para el íleon por hematoxilina y eosina para cuatro grupos experimentales. Los datos se presentan como medias ± SEM (n = 7–8 por grupo). ANOVA unidireccional o ANCOVA (ingesta de alimentos) seguido de una prueba LSD post hoc. *P < 0,05, versus control, #P < 0,05 versus PTU. Letras diferentes sobre las columnas indican diferencias significativas. Con, grupo de control que recibió solo solución salina; PTU, las ratas que recibieron 10 mg/kg/cuerpo de propiltiouracilo (PTU); YJT + PTU, las ratas que recibieron 2,1 g/kg YJT y 10 mg/kg/cuerpo PTU; T4 + PTU, las ratas que fueron tratadas con 0,5 mg/kg de L-tiroxina y 10 mg/kg de PTU.

Para una mayor detección de los genes relevantes para mantener la barrera intestinal, la señalización intestinal y las citocinas inflamatorias que fueron moduladas por YJT, las expresiones de ARNm de varios marcadores clave se cuantificaron mediante una reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) en el íleon del intestino delgado. De acuerdo con la histología del íleon, la expresión de claudina-2 y zonula occludens-1 (ZO-1, las moléculas de unión estrecha epitelial) tendió a disminuir o disminuyó significativamente en las ratas tratadas con PTU en comparación con los controles. Además, estos cambios se recuperaron parcial o completamente con los tratamientos YJT y T4 (Fig. 2a). En contraste con YJT, el tratamiento con T4 aumentó la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA, un marcador para la proliferación celular, Fig. 2a) y la histona desacetilasa 4 (HDAC4, Fig. 2a). El tratamiento con YJT atenuó los aumentos inducidos por PTU en la expresión génica de citocinas proinflamatorias e inflamatorias, incluido el factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de las células B activadas (NF-κB), TNF-α, interleucina 6 (IL-6), e IL-15, mientras que el tratamiento con T4 no demostró este efecto preventivo sobre la inflamación intestinal (Fig. 2a). Además, el tratamiento con T4 indujo la expresión de NF-κB (Fig. 2a) y estimuló la expresión del canal de potencial receptor transitorio de vaniloide tipo 1 (Trpv1) en lugar de Trpv3 o Trpv4 (sensación de calor, inflamación y dolor, Fig. 2b). Además, los tratamientos con YJT y T4 revirtieron la reducción inducida por PTU en la expresión de Dio1, y YJT incluso indujo un aumento de 4,5 veces en la expresión de Dio2 (Fig. 2b), mejorando la conversión de T4 inactiva a T3 biológicamente activa. La expresión de tirosina hidroxilasa (Th, una enzima limitante de la velocidad para la síntesis de norepinefrina (NE)) disminuyó y triptófano hidroxilasa 2 (Tph2, una enzima limitante de la velocidad para la síntesis de 5-hidroxitriptamina (5-HT)) aumentó en pacientes tratados con PTU. ratas, que se revirtieron con tratamientos YJT y T4 (Fig. 2b). Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión del receptor 5-HT HTR1F (Fig. 2b). En comparación con las ratas tratadas con PTU, el tratamiento con YJT inhibió la expresión de GLP-1R junto con una caída en los niveles séricos de GLP-1 (Fig. 2b), aliviando la hipofagia en el hipotiroidismo. Además, el tratamiento con YJT aumentó la expresión de los receptores de ácidos grasos libres 3 (FFAR3), pero no de FFAR2 (ambos son receptores de metabolitos bacterianos de ácidos grasos de cadena corta, SCFA), y aumentó el receptor 5 acoplado a proteína G de Takeda (TGR5), pero no receptor farnesoide X (FXR) (los dos últimos son receptores de ácidos biliares, BA) en comparación con el del grupo tratado con PTU (Fig. 2c). Además, las regulaciones a la baja significativas de los sensores intestinales, como un receptor acoplado a proteína G sensible al pH (GPR65), un receptor tipo toll 4 (TLR-4, que detecta LPS bacteriano), un dominio de oligomerización de unión a nucleótidos 2 (Nod2, unión peptidoglicano bacteriano) y la proteína de reconocimiento de peptidoglicano 1 (Pglyrp1) se observaron en el grupo tratado con YJT en comparación con las ratas tratadas con PTU, mientras que la regulación positiva de la expresión de Pglyrp2 en el grupo tratado con T4 en comparación con todos los demás grupos es notable (Fig. 2c). Estos datos indican que YJT promueve la expresión génica intestinal ampliamente relacionada con la función enteroendocrina, la conversión de la hormona tiroidea y múltiples vías de señalización, e inhibe la inflamación intestinal asociada al hipotiroidismo.

a Los genes para los marcadores de unión estrecha intestinal claudina-2 y zonula occludens-1 (ZO-1), antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), histona desacetilasa 4 (HDAC4) y los marcadores inflamatorios factor nuclear potenciador de cadena ligera kappa de células B activadas (NF-κB), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina 6 y 15 (IL-6 e IL-15). b Canal de potencial receptor transitorio de los tipos vanilloide 1, 3 y 4 (Trpv1, Trpv3 y Trpv4), yodotironina desyodasa tipo 1 y 2 (Dio1 y Dio2), tirosina hidroxilasa (Th), triptófano hidroxilasa 2 (Tph2), 5- receptor de hidroxitriptamina 1 F (HTR1F) y receptor de péptido similar al glucagón-1 (GLP-1R). c Receptores de ácidos grasos libres 2 y 3 (FFAR2 y FFAR3), receptor de ácidos biliares acoplado a proteína G 5 (TGR5), receptor farnesoide X (FXR), receptor acoplado a proteína G 65 (GPR65), receptor tipo Toll 4 ( TLR4), receptores tipo Nod 2 (Nod2), proteínas de reconocimiento de peptidoglicano 1 y 2 (Pglyrp1 y Pglyrp2). Los datos se presentan como medias ± SEM (n = 7–8 por grupo). ANOVA unidireccional seguido de prueba LSD post hoc. *P < 0,05 y **P < 0,01. Letras diferentes sobre las columnas indican diferencias significativas. Con, grupo de control que recibió solo solución salina; PTU, las ratas que recibieron 10 mg/kg de propiltiouracilo (PTU); YJT + PTU, las ratas que recibieron 2,1 g/kg YJT y 10 mg/kg PTU; T4 + PTU, las ratas que fueron tratadas con 0,5 mg/kg de L-tiroxina y 10 mg/kg de PTU.

Para determinar si el hipotiroidismo altera la comunidad de la microbiota intestinal y si esta alteración podría prevenirse mediante el tratamiento con YJT, analizamos secuencias del gen 16 S rRNA de las 26 muestras fecales entre los cuatro grupos experimentales. La curva de rarefacción del índice de cobertura de bienes para las muestras alcanzó la saturación (Figura complementaria 2a), lo que refleja que se identificaron numerosas bacterias en las muestras. Aunque la diversidad de especies dentro de las muestras (diversidad α) no indicó diferencias entre los tratamientos (Tabla complementaria 1), la diversidad β demostró segregación para la estructura de la comunidad microbiana, como lo indican los análisis de coordenadas principales (PCoA) basados en Bray-Curtis. índice de disimilitud (Fig. 3a). Cada grupo exhibió variantes de secuencia de amplicón central específicas (ASV) en el 85% de las muestras en cada grupo (Figura 2b complementaria). El diagrama circular mostró los 10 géneros principales, excepto los taxones no cultivados (Fig. 3b). Los biomarcadores para diferentes grupos se identificaron mediante un análisis discriminante lineal (LDA) junto con el tamaño del efecto LDA (LEfSe) (Figura 2c complementaria). Las ratas tratadas con PTU se vieron afectadas por una mayor proporción de géneros como Prevotellaceae, Parabacteroides, Rikenellaceae y Ruminococcaceae, pero exhibieron una menor proporción de Ruminiclostridium y Mucispirillum, y estos cambios se recuperaron al nivel de control con los tratamientos YJT o T4.

a La diversidad β indicada por los análisis de coordenadas principales (PCoA) basados en la disimilitud de Bray-Curtis en las abundancias de variantes de secuencia de amplicón (ASV) para analizar y visualizar similitudes y diferencias entre muestras. Los diagramas de caja en la parte superior y derecha muestran los índices de disimilitud de Bray-Curtis a lo largo del eje PCo1 y PCo2 para los sujetos en cada grupo, y las diferencias estadísticas se determinaron mediante análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA). b El gráfico circular que muestra los 10 géneros principales excepto los taxones no cultivados. c La abundancia relativa de diferentes bacterias a nivel de género (la línea central representa la mediana de los datos, los límites del cuadro representan el rango del 50 % medio de los datos y los bigotes representan la dispersión de los datos más allá del cuadro). d Mapa de calor de coeficientes de correlación entre géneros específicos y expresión de ARNm de diferentes marcadores y receptores intestinales. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y NS, no significativo. Letras diferentes sobre las columnas indican diferencias significativas. Con, grupo de control que recibió solo solución salina; PTU, las ratas que recibieron 10 mg/kg de propiltiouracilo (PTU); YJT + PTU, las ratas que recibieron 2,1 g/kg YJT y 10 mg/kg PTU; T4 + PTU, las ratas que fueron tratadas con 0,5 mg/kg de L-tiroxina y 10 mg/kg de PTU.

A continuación, realizamos análisis de red de co-ocurrencia y correlación de Pearson para revelar las posibles correlaciones entre biomarcadores y entre la microbiota intestinal y los biomarcadores del huésped. Se observó que algunos géneros como Parabacteroides, Prevotellaceae, Rikenellaceae, Ruminococcaeae, Lactobacillus y Elusimiccobium tenían una correlación negativa, mientras que Ruminiclostridium y Ruminococcaceae sin clasificar, y Roseburia tenían una correlación positiva con la ingesta de alimentos, los niveles séricos de T4 y la Tb (Figura complementaria 2d y S2e). Los sensores intestinales: GPR65, TLR4, NOD2, Pglyrp1 y Pglyrp2 se correlacionaron positivamente entre sí y se combinaron con IL-6 y TNF-α inflamatorios (Fig. 3e, S2f). Además, los marcadores de unión estrecha del epitelio intestinal (claudin-2 y ZO-1) se correlacionaron negativamente con Turicibacter, Ruminococcaceae UCG-010 y Peptococcaceae_unclassified; además, Turicibacter también se correlacionó negativamente con Trpv1 (Fig. 3e, Figura complementaria 3). Dentro de esta red de co-ocurrencia, los géneros bacterianos diferenciales generaron principalmente tres unidades enriquecidas covariantes, que son los géneros: Parabacterioides pertenecientes a f_Tannerellaceae (p_Bacteroidota), siete géneros (en letra roja) pertenecientes a f_Ruminococcaceae (p_Firmicutes), y nueve géneros (en letra amarilla) perteneciente a f_Lachnospiraceae (p_Firmicutes). Estos géneros del mismo p_Firmicutes suelen estar positivamente correlacionados entre sí, mientras que están negativamente correlacionados con el género de p_Bacteroidota. En conjunto, esta amplia red de coexpresión entre géneros de bacterias diferenciales y fenotipos del huésped implica el papel potencial de los microbios intestinales en la regulación de la alimentación del huésped, la tuberculosis, la barrera intestinal y la inflamación.

Para confirmar aún más las funciones de la microbiota intestinal en la mediación de la termorregulación inducida por YJT y la hipótesis de prevención de la inflamación, realizamos una CMT. La microbiota cecal de las ratas tratadas con PTU, YJT + PTU, T4 + PTU o Control se transfirió a receptores tratados con antibióticos, que se denominaron CMTPTU, CMTYJT, CMTT4 y CMTCon, respectivamente (Fig. 4a ). Como predijimos, los receptores exhibieron fenotipos térmicos e inflamatorios similares a los de sus donantes (Figs. 4b, c). Un tratamiento con antibióticos durante una semana resultó en una disminución crónica en los niveles de Tb incluso 2 semanas después de la finalización, sin cambios significativos en la masa corporal o la ingesta de alimentos (Fig. 4b, Figura complementaria 4a, b). Las ratas CMTPTU demostraron niveles más bajos de Tb e ingesta de alimentos que el grupo del vehículo, mientras que las ratas CMTYJT y CMTT4 no mostraron una diferencia significativa o incluso tenían una Tb más alta que la del grupo del vehículo (Fig. 4b). Además, las ratas CMTPTU exhibieron niveles más altos de glucosa en sangre, GLP-1 sérico y LPS, pero demostraron niveles séricos más bajos de T3, T4, grelina y longitudes de cripta más bajas en el íleon que en los otros grupos (Fig. 4c-i).

una descripción esquemática del diseño experimental. b Temperatura corporal central promedio (Tb) durante el proceso del experimento (n = 4 por grupo). c Niveles de glucosa en sangre. d-h La tiroxina sérica (T4), la triyodotironina (T3), la grelina, el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) y los lipopolisacáridos (LPS) por ELISA. i Ensayo histológico del íleon mediante tinción con hematoxilina y eosina para cuatro grupos experimentales. La barra de escala es de 500 µm. Los datos se presentan como medias ± SEM. ANOVA unidireccional seguido de prueba LSD post hoc. *P < 0.05 vs vehículo. Letras diferentes sobre las columnas indican diferencias significativas. Vehículo, las ratas de control que fueron alimentadas por vía oral con solución salina tamponada con fosfato (PBS); CMTPTU, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con PTU; CMTYJT, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con YJT + PTU; CMTT4, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con L-tiroxina+PTU; CMTCon, las ratas que fueron colonizadas con microbiota cecal de donantes de control.

El BAT es un órgano termogénico importante con la proteína mitocondrial única que desacopla la proteína 1 (UCP1) en pequeños mamíferos y también en humanos18,19. Además, cuantificamos las expresiones de ARNm de los genes relacionados con la termogénesis en BAT y los genes con relevancia en el mantenimiento de la barrera intestinal, las hormonas intestinales, la señalización nerviosa o inmunitaria y los biomarcadores relacionados con la inflamación en el íleon a través de RT-qPCR en las ratas tratadas con antibióticos. que se transfirieron con microbiota cecal de ratas tratadas con PTU, tratadas con YJT + PTU, tratadas con T4 + PTU y control. Con respecto a los cambios en la Tb, se observó que el grupo CMTYJT mostró principalmente niveles más altos de ARNm de Adrb3 (receptores beta 3-adrenérgicos), Cidea (factor de fragmentación de ADN inductor de muerte celular-alfa (DFFA)-like efector a, que es un factor transcripcional coactivador), PPAR-α (receptor alfa activado por proliferador activado por proliferador), PPAR-γ, PRDM16 (dominio regulador positivo que contiene 16) y UCP1 (proteína desacopladora 1), y un nivel más bajo de Fabp4 (proteína de unión a ácidos grasos 4) en el BAT que en el grupo CMTPTU, mientras que otros genes como PGC-1α (coactivador 1α del receptor activado por proliferador γ) y Dio2 no difirieron entre los grupos (Fig. 5a). Estos datos respaldan que la microbiota tratada con YJT activó la función de termogénesis de BAT.

a Receptor adrenérgico beta-3 (Adrb3), efector A similar al factor de fragmentación del ADN que induce la muerte celular (Cidea), coactivador 1α del receptor activado por proliferador γ (PGC-1α), receptor alfa activado por proliferador (PPAR-α), proliferador receptor-gamma activado (PPAR-γ), dominio regulador positivo que contiene 16 (PRDM16), proteína de unión a ácidos grasos 4 (Fabp4), proteína de desacoplamiento 1 (UCP1) y yodotironina desyodasa tipo 2 (Dio2). b Claudin-2, zonula occludens-1 (ZO-1), antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), histona desacetilasa 4 (HDAC4), potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de células B activadas (NF-κB), tumor factor de necrosis-α (TNF-α) e interleucina 6 y 15 (IL-6 e IL-15). c Canal de potencial receptor transitorio de los tipos 1, 3 y 4 de vaniloide (Trpv1, Trpv3 y Trpv4), yodotironina desyodasa tipo 1 y 2 (Dio1 y Dio2), tirosina hidroxilasa (Th), triptófano hidroxilasa 2 (Tph2), 5- receptor de hidroxitriptamina 1 F (HTR1F) y receptor de péptido similar al glucagón-1 (GLP-1R). d Receptores de ácidos grasos libres 2 y 3 (FFAR2 y FFAR3), receptor de ácidos biliares acoplado a proteína G 5 (TGR5), receptor farnesoide X (FXR), receptor acoplado a proteína G 65 (GPR65), receptor tipo toll 4 ( TLR4), receptores tipo nod 2 (Nod2), proteínas de reconocimiento de peptidoglicano 1 y 2 (Pglyrp1 y Pglyrp2). ANOVA unidireccional seguido de prueba LSD post hoc. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. Las diferentes letras sobre las columnas indican diferencias significativas. Vehículo, las ratas de control que fueron alimentadas por vía oral con solución salina tamponada con fosfato (PBS); CMTPTU, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con PTU; CMTYJT, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con YJT + PTU; CMTT4, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con L-tiroxina+PTU; CMTCon, las ratas que fueron colonizadas con microbiota cecal de donantes de control.

En el íleon, la expresión de claudina-2 fue significativamente mayor en el grupo CMTT4 que en los grupos CMTPTU y CMTYJT (Fig. 5b), sin diferencias en ZO-1, PCNA o HDAC4. El grupo CMTYJT tuvo valores de NF-κB y TNF-α relativamente más bajos que los del grupo CMTPTU, mientras que los niveles de NF-κB e IL-15 fueron más altos en las ratas CMTT4 que en las ratas CMTYJT (Fig. 5b). La expresión de Trpv1 y Trpv3 fue mayor en el grupo CMTYJT que en el grupo CMTYJT, mientras que la expresión de Trpv4 no difirió entre los grupos (Fig. 5c). La expresión de Dio1 fue menor tanto en los grupos CMTPTU como en CMTYJT que en el grupo CMTCon, mientras que Dio2 fue mayor en el grupo CMTYJT en comparación con los otros grupos (Fig. 5c). Tanto la expresión de Th como la de Tph no mostraron diferencias en los grupos; sin embargo, se observó que HTR1F se expresaba débilmente en los grupos CMTPTU y CMTT4 (Fig. 5c). La expresión de GLP-1R fue menor en el grupo CMTT4 que en el grupo CMTPTU (Fig. 5c). Además, se observaron regulaciones al alza en la expresión de ARNm de los receptores, como FFAR2, FFAR3 y FXR excepto TGR5, y una marcada regulación a la baja en TLR-4 en el grupo CMTYJT en comparación con el grupo CMTPTU; GPR65, Nod2, Pglyrp1 y Pglyrp2 mostraron una menor cantidad en ratas CMTYJT frente a CMTPTU (Fig. 5d). Estos resultados indican que la microbiota tratada con YJT regula múltiples vías de señalización relacionadas con bacterias y atenúa la inflamación intestinal asociada con el hipotiroidismo.

Realizamos la secuenciación y el análisis del gen 16 S rRNA en las muestras fecales de todos los donantes y receptores para confirmar la eficacia de la colonización bacteriana y comparar las diferencias de grupo en los receptores. Aunque las diversidades α y β de la comunidad de microbiota intestinal en los receptores fueron diferentes de las de los donantes (Figura complementaria 5a, b; Tablas complementarias 2–5), algunos géneros específicos, como Mucispirillum, Prevotellaceae y Turicibacter, exhibieron patrones similares con los de los destinatarios (Figura complementaria 5c). Además, la diversidad β mostró separación entre grupos en las ratas receptoras (Fig. 6a). Los biomarcadores bacterianos en cada grupo se seleccionaron en los receptores (Fig. 6b), y las ratas CMTYJT mostraron una mayor abundancia relativa de Candidatus_Arthromitus y una menor abundancia de Prevotellaceae y Turicibacter en comparación con las ratas CMTPTU; mientras que Ruminococcaceae se sobreexpresó en ratas CMTT4 (Fig. 6c), lo que indica las diversas estructuras y composiciones de la comunidad de microbiota intestinal debido a CMT de diferentes donantes (Fig. 6c).

a La diversidad β indicada por los análisis de coordenadas principales (PCoA) de los análisis de coordenadas principales (PCoA) basados en la disimilitud de Bray-Curtis en las abundancias de variantes de secuencia de amplicón (ASV) para analizar y visualizar similitudes y diferencias entre muestras. Los diagramas de caja en la parte superior y derecha muestran los índices de disimilitud de Bray-Curtis a lo largo del eje PCo1 y PCo2 para los sujetos en cada grupo, y las diferencias estadísticas se determinaron mediante análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA). b Taxonomía bacteriana diferencial seleccionada por análisis LEfSe con una puntuación LDA >2 en la comunidad de microbiota fecal. c Abundancia relativa de diferentes bacterias a nivel de género ("+" indica la media de los datos). d Gráfico combinado de la prueba de Mantel y la correlación de Pearson entre los marcadores intestinales y la taxonomía de bacterias. e Mapa de calor de coeficientes de correlación entre géneros específicos y expresión de ARNm de diferentes marcadores y receptores intestinales. ANOVA unidireccional seguido de prueba LSD post hoc. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. Las diferentes letras sobre las columnas indican diferencias significativas. Vehículo, las ratas de control que fueron alimentadas por vía oral con solución salina tamponada con fosfato (PBS); CMTPTU, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con PTU; CMTYJT, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con YJT+ PTU; CMTT4, las ratas que fueron colonizadas por microbiota cecal de donantes tratados con L-tiroxina+PTU; CMTCon, las ratas que fueron colonizadas con microbiota cecal de donantes de control.

Además, los análisis de red de correlación y coocurrencia de Pearson revelaron correlaciones potenciales para la abundancia de estas bacterias intestinales y fenotipos metabólicos diferenciales, como los niveles séricos de T4 (Figura complementaria 6a, b) y la expresión génica relacionada con la termogénesis de BAT (Figura complementaria 6c, d) y fabricantes de inflamación intestinal (Figs. 6d, e). La Tb central puede ser detectada por Trpv1 intestinal y regulada por los niveles séricos de T3 y los reguladores BAT (Figura 7 complementaria). El género Alistipes se correlacionó negativamente con la expresión de FFAR2 intestinal; además, Lactobacillus y Eisenbergiella se correlacionaron negativamente con los niveles séricos de GLP-1 y LPS, respectivamente (Figura 7 complementaria). En general, los análisis de la red de co-ocurrencia revelan que la interacción de las bacterias inducidas por CMT contribuye a las regulaciones de la termogénesis BAT y la inflamación sistémica.

Recientemente, a pesar de extensos estudios sobre HM como un agente prometedor para tratar enfermedades relacionadas con el metabolismo, el conocimiento sobre la combinación de HM y microbioma intestinal es limitado, y varias preguntas en este campo que pueden ayudar a mantener el estado de salud humana siguen sin respuesta15. Al combinar estos dos campos interdependientes en este estudio, demostramos que la administración de YJT ejerció efectos notables sobre la Tb y el metabolismo de la hormona tiroidea en ratas con hipotiroidismo inducido por PTU. Mientras tanto, según los resultados de la secuenciación del gen 16 S rRNA y la transferencia de microbiota, los efectos de YJT podrían interpretarse y confirmarse mediante cambios en la comunidad microbiana intestinal y, por lo tanto, mediante la regulación de un conjunto específico de receptores (p. ej., FFAR2 /FFAR3, TGR5/FXR, Pglyrp1/2/Nod2 y TLR4) que pueden reconocerse como metabolitos bacterianos y componentes de la pared celular. Destacamos la vía de cascada de señalización YJT-microbiota-gut en la mediación de las propiedades cálidas de YJT para activar la termogénesis y prevenir la inflamación sistémica.

El hipotiroidismo es uno de los trastornos metabólicos más comunes asociados con la disbiosis intestinal y sistémica20. Según se informa, las ratas con hipotiroidismo inducido por PTU tienen niveles de hormona tiroidea similares a los de los humanos con hipotiroidismo6. Por lo tanto, en nuestro estudio, el tratamiento con PTU indujo hipotiroidismo en ratas Sprague-Dawley (SD). Como era de esperar, el tratamiento con PTU condujo a una pérdida de apetito, inhibición del metabolismo energético basal y reducción de la Tb. Estos fenotipos metabólicos se asociaron con un aumento de los niveles circulantes de la hormona intestinal anoréxica GLP-1, y niveles bajos de grelina orexígena, y niveles reducidos de hormona tiroidea en ratas hipotiroideas. Los trastornos en la comunidad de microbiota intestinal y la mejora de la inflamación sistémica fueron los resultados más notables en nuestro modelo de rata PTU. Además, los receptores que fueron transferidos con microbiota de ratas hipotiroideas demostraron fenotipos metabólicos e inflamatorios similares a los de sus donantes, lo que también se observó en estudios anteriores21. Por lo tanto, estos datos indican el papel patogénico de la microbiota del hipotiroidismo en la conformación del hipometabolismo y la hiperinflamación.

Para interpretar estos cambios considerando la contribución de la microbiota intestinal a la producción de hormonas intestinales y citoquinas inflamatorias, detectamos la expresión de ARNm de algunos de los receptores y biomarcadores más importantes en el intestino delgado. En particular, los receptores de reconocimiento de patrones innatos, como Nod2, Pglyrp1, 2 (sensores de peptidoglicano) y TLR4 (receptor LPS), son esenciales para las respuestas inflamatorias de los mamíferos y la producción de péptidos antimicrobianos22. Observamos aumentos significativos en las expresiones de GPR65, Nod2, Pglyrp1 y TLR4 en ratas tratadas con PTU. Estos receptores, a través del reconocimiento de componentes bacterianos (peptidoglicano y LPS), activaron respuestas inflamatorias, rompieron la barrera intestinal y redujeron el apetito al aumentar la secreción de GLP-123,24,25. Además, se ha demostrado que el LPS bacteriano inhibe la actividad de Dio y disminuye el nivel de T3 en la circulación y, por lo tanto, provoca hipotermia26,27,28. Además, los datos actuales respaldan que Roseburia, Lachnospiraceae, Peptococcaceae y Ruminiclostridium se relacionaron positivamente con Tb, mientras que Parabacteroides, Rikenellaceae y Ruminococcaceae se correlacionaron negativamente con Tb. De acuerdo con estos datos, previamente detectamos cambios similares en la flora del modelo de hipotiroidismo en jerbos29. Además, las disminuciones en la longitud de las vellosidades, la profundidad de las criptas y las moléculas de unión estrecha intestinal en ratas hipotiroideas demostraron una alteración en la absorción intestinal y la barrera que conduce a un aumento de las respuestas inflamatorias sistémicas30. En conjunto, la disbiosis de la microbiota intestinal a través de la activación de las vías de señalización LPS-TLR4 y peptidoglicano-Nod2/Pglyrp1 puede estar relacionada con un metabolismo reducido y una inflamación sistémica mejorada en ratas hipotiroideas.

El tratamiento con L-tiroxina como método convencional para la terapia del hipotiroidismo remedió la pérdida de masa corporal y la ingesta de alimentos en ratas hipotiroideas. Mientras tanto, según la dosis recomendada en estudios anteriores, los datos actuales indican aumentos notables en la ingesta de alimentos y los niveles de Tb en ratas tratadas con T4; aumento de peso de algunos órganos, incluidos el bazo, el corazón y el hígado; aumento de la longitud de las vellosidades y las criptas y aumento de la proliferación de células intestinales; y la sobreexpresión de varios marcadores proinflamatorios e inflamatorios en estas ratas tratadas con T4. Se informó que HDAC4, una de las enzimas involucradas en la modificación postraduccional, estimula la proliferación celular y mejora la unión estrecha epitelial31, lo que respalda nuestro hallazgo de alta expresión en HDAC4 intestinal, PCNA y marcadores de unión estrecha en ratas tratadas con T4. Estos datos indican que el tratamiento con T4 como terapia para el hipotiroidismo genera eventos adversos, como hiperfagia, hipertermia e hiperinflamación.

En este estudio, la administración de YJT en ratas con hipotiroidismo inducido por fármacos resolvió la reducción de la Tb y previno la inflamación sistémica. Si bien la composición exacta y los componentes activos de YJT no se conocen por completo, existe cierta evidencia que sugiere que contiene compuestos con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, como flavonoides y liquiritigenina, así como polisacáridos prebióticos16. Estos componentes bioactivos pueden ser detectados directamente por los canales TRP epiteliales intestinales, regular la secreción de hormonas (como GLP-1, leptina y adiponectina) y contribuir a sus beneficios potenciales en BAT y vías relacionadas32,33. Alternativamente, estos productos derivados de plantas pueden fermentarse en SCFA para ejercer efectos antiinflamatorios y termogénicos en el cuerpo34. Para investigar si la microbiota intestinal desempeñó un papel en los efectos beneficiosos de la administración de YJT sobre los síntomas de hipotiroidismo, transferimos la microbiota del ciego de los donantes tratados con YJT a las ratas tratadas con antibióticos. El tratamiento con antibióticos no pudo agotar la microbiota por completo, pero redujo la comunidad microbiana existente con el fin de eliminar la influencia de la microbiota inherente de los receptores y creó un ambiente receptivo para la colonización por la microbiota de los donantes, que se ha aplicado de manera efectiva para la investigación de la función desempeñada. por la microbiota intestinal35,36. Aunque la microbiota de los donantes no pudo colonizar totalmente los intestinos de los receptores debido a la competencia con los microorganismos inherentes, algunos géneros específicos exhibieron patrones cambiantes similares con los donantes. El mismo procedimiento de CMT también se aplicó en los estudios previos37. Estos datos demuestran la eficacia del injerto y que los receptores obtienen fenotipos metabólicos e inflamatorios similares a los de los donantes.

La transferencia de microbiota también puede brindar la eficacia de YJT en la expresión de genes relacionados con la inflamación en el intestino delgado y genes relacionados con la termogénesis en BAT. El aumento de la expresión génica de la enzima limitante de la velocidad (Th) para la síntesis de NE en las ratas CMTYJT contribuye a la activación de la termogénesis BAT. Además, también se consideró que la expresión creciente de Dio2 intestinal, que promueve la conversión de T4 inactiva a T31,29 biológicamente activa, induce la termogénesis en ratas CMTYJT. Estos hallazgos sugieren que la microbiota YJT o tratada con YJT puede afectar la producción y el procesamiento de estos neurotransmisores y hormonas en el cuerpo, lo que a su vez puede contribuir a sus propiedades cálidas. Nuestros datos indican además que los receptores relacionados con metabolitos bacterianos, como FXR y/o TGR5 (para BA) y FFAR2 y/o FFAR3 (para SCFA) pueden estar involucrados en la regulación de neurotransmisores y hormonas intestinales. Estudios previos han sugerido la importancia de la señalización BA-TGR5/FXR-Dio para mejorar el gasto energético y el control de la glucosa38,39,40. Además, nuestros datos respaldan que la reducción en la señalización intestinal de LPS-TLR4 y peptidoglicano-Nod2/Pglyrp1 puede transmitir el efecto antiinflamatorio de la microbiota tratada con YJT o YJT. Además, un aumento en la expresión de Trpv1 y Trpv3 en los receptores de la microbiota tratada con YJT está involucrado en la sensación de inflamación, dolor y calor y las consiguientes regulaciones de Tb41,42. Teniendo en cuenta la literatura anterior y los datos actuales, Oscillibacter, que demostró una correlación positiva con la expresión de Dio1, puede mejorar la respuesta antiinflamatoria43. Además, la disminución en la proporción de Firmicutes a Bacteroidetes es otro cambio que observamos en el grupo tratado con YJT, que anteriormente se asoció con un supuesto estado de enfermedad44. Nuestro estudio demuestra que la microbiota intestinal tratada con YJT puede ejercer efectos sobre la actividad del sistema inmunitario innato intestinal y proteger a los animales contra la hiperinflamación inducida por el hipotiroidismo. Además, los datos sugieren un papel fundamental del eje microbiota-intestino-BAT en la mediación de la termorregulación inducida por YJT.

Por lo tanto, YJT puede actuar como un prebiótico al cambiar los taxones de microbiota intestinal, elevar la Tb y aliviar las respuestas inflamatorias relacionadas con el hipotiroidismo. Estos efectos sobre la termogénesis pueden estar relacionados con el aumento de la expresión de Th y Dio2 que están implicados en la síntesis de norepinefrina y el metabolismo de las hormonas tiroideas en el intestino delgado, activando finalmente la vía termogénica en el BAT. En contraste con el fármaco convencional L-tiroxina para curar el hipotiroidismo, YJT tiene una eficacia única para atenuar las respuestas inflamatorias sistemáticas a través de la supresión de las vías de señalización intestinal LPS-TLR4 y peptidoglicano-Nod2/Pglyrp1 (Fig. 7). En conjunto, los datos informados actualmente sugieren que las propiedades termogénicas y antiinflamatorias beneficiosas de YJT pueden estar asociadas con la alteración en la microbiota intestinal, a través del eje microbiota-intestino-BAT. Se debe tener cuidado al interpretar estos hallazgos debido al número limitado de individuos por grupo. Los componentes activos exactos de YJT y los mecanismos por los cuales regulan la homeostasis térmica, energética e intestinal aún deben caracterizarse completamente para comprender su función prebiótica. Dada la naturaleza generalizada de HM en la salud humana, estos hallazgos pueden abrir una nueva ventana al sistema médico moderno al fortalecer la justificación de un cambio de paradigma para potenciar la medicina centrada en holobiontes.

Las ratas hipotiroideas tratadas con propiltiouracilo (PTU) presentan hipotermia, hipofagia e hiperinflamación, que se han asociado con disbiosis de la microbiota intestinal, particularmente con Prevotellaceae extremadamente enriquecidas. Como prebiótico, Yijung-tang (YJT) modula la microbiota intestinal y los receptores relacionados con metabolitos (p. ej., FFAR3 y TGR5/FXR) para estimular la expresión génica de la tirosina hidroxilasa intestinal (Th) para la síntesis de norepinefrina y la yodotironina desyodasas 2 (Dio2) para metabolismo de la hormona tiroidea y, en consecuencia, activa la vía termogénica en el tejido adiposo pardo (BAT) y atenúa la inflamación sistémica relacionada con el hipotiroidismo. Por el contrario, el tratamiento con L-tiroxina (T4) en ratas hipotiroideas estimula la secreción de grelina y activa las vías de señalización intestinal LPS-TLR4 y peptidoglicano-Pglyrp2, y conduce a hipertermia, hiperfagia e hiperinflamación.

YJT se adquirió en la tienda de suministros médicos del Hospital Internacional de la Universidad de Dongguk (Ilsan, Goyang-si, República de Corea). Los materiales vegetales secos se molieron en un polvo grueso apropiado utilizando un molinillo doméstico, se sumergieron en un volumen de 10 veces de etanol al 30% (v/v) y se hirvieron durante 2 h. Posteriormente, la solución se enfrió a temperatura ambiente durante 1 h y se sometió a centrifugación a 1700 × g durante 20 min para recolectar el sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro Whatman y luego se evaporó a presión reducida a 50 °C utilizando un evaporador rotatorio (EYELA N-1200A, EYELA, Tokio, Japón) para obtener el extracto inicial. Este producto acuoso inicial se liofilizó utilizando un liofilizador (Bondiro, IlshinBioBase, Dongducheon, República de Corea) y el extracto final se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. Las dosis de YJT se calcularon como una relación de dosis equivalente de humano a rata de acuerdo con las instrucciones anteriores45. Por lo tanto, las dosis únicas equivalentes de YJT para ratas se calcularon en 2,1 g/kg/día.

Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de tres semanas de edad (con una masa corporal de ~ 100 g) de DBL (277 Deokho-ro, Eumseong-jun, Chung Cheong buk-do, República de Corea). Después de 7 días de cuarentena para prevenir la transmisión microbiana y controlar la ingesta de alimentos con precisión, todos los animales se separaron en jaulas individuales y se les proporcionó pienso estándar para ratas (Carjill Ajri Purina, Seongnumsi, Gyeonggi-do, República de Corea) y agua ad libitum. Se alojaron en condiciones estándar de laboratorio a una temperatura ambiente de 22 ± 3 °C con una humedad del 60 ± 5 % y un ciclo diario de luz/oscuridad de 12/12 h durante el transcurso del experimento. Todos los procedimientos del estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Dongguk (número de aprobación: IACUC-202201223) y se realizaron de conformidad con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio".

El Experimento 1 fue diseñado para probar los efectos de YJT en la Tb, la expresión génica, los metabolitos séricos y la comunidad microbiana intestinal. En el primer grupo de ratas, se implantó Thermochron iButton en el abdomen y, 1 semana después de la operación, los animales se dividieron en cuatro grupos. A un grupo de control (Con) se le inyectó por vía subcutánea 0,3 ml de solución salina/animal durante el período experimental, y a los otros 3 grupos de ratas se les administró una inyección subcutánea diaria de 10 mg de PTU/kg de masa corporal en la parte dorsal del cuello durante un período de 2 semanas (Tratamiento 1)6,7. Estos 3 grupos estaban entonces bajo diferentes tratamientos. El grupo tratado con PTU solo recibió PTU, y los otros dos grupos recibieron no solo PTU sino también 0,5 mg/kg/día de L-tiroxina (T4, como fármaco de referencia) o 2,1 g/kg/día de YJT durante 4 semanas (Tratamiento 2) (Fig. 1a). La masa corporal (±0,1 g) y el consumo de alimentos se controlaron durante el transcurso del experimento. Al final del período experimental, se recolectaron heces frescas de cada rata, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para la extracción de ADN. Se recogieron muestras de sangre de la vena infraorbitaria y luego se centrifugaron a 1500 × g durante 30 min para obtener suero. Después del tratamiento, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 12 h y se sacrificaron bajo anestesia mediante la administración de Zoletil® (tiletamina-zolazepam, Virbac, Carros, Francia) y Rompun® (xilazina-clorhidrato, Bayer, Leverkusen, Alemania) de acuerdo con un estudio previo. protocolo46. Se recogieron los contenidos cecales de cada rata, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para el experimento de CMT. El intestino delgado se extirpó, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para mediciones posteriores.

El Experimento 2 a través de CMT se diseñó para examinar el papel de la microbiota intestinal en la mediación de los efectos de YJT en la Tb, la expresión génica y los metabolitos séricos en ratas con hipotiroidismo inducido por PTU. El otro grupo de ratas que recibieron la implantación de iButton se dividió en 5 grupos después de un período de recuperación de 1 semana (Fig. 4a). Para la CMT simulada, las ratas receptoras recibieron una sonda intragástrica de 500 μl de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, vehículo) durante el experimento y se nombraron como grupo vehículo. A los otros 4 grupos se les administró un cóctel de antibióticos (100 mg/kg de estreptomicina, 200 mg/kg de ampicilina, 200 mg/kg de neomicina, 200 mg/kg de metronidazol y 100 mg/kg de vancomicina) por sonda intragástrica una vez al día (500 μL por día) durante 7 días47. Luego, estas ratas tratadas con antibióticos se transfirieron aleatoriamente con la microbiota cecal de los donantes tratados con PTU, YJT + PTU y T4 + PTU y control mediante sonda intragástrica (500 μL por día) durante 3 días a la semana (continuamente). durante 3 semanas), y nombrados como CMTPTU, CMTYJT, CMTT4 y CMTCon, respectivamente (Fig. 4a). Se recogieron heces frescas, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para la posterior extracción de ADN. El intestino delgado y BAT también se sumergieron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis.

Los contenidos cecales se recogieron de los grupos tratados con PTU, YJT + PTU y T4 + PTU y de control en Exp. 1, respectivamente. Estos contenidos cecales (200 mg) de 3 donantes de cada grupo se combinaron, se diluyeron en 2 ml de PBS estéril, se homogeneizaron durante 15 s y se centrifugaron (500 × g, 4 °C, 5 min) para eliminar los residuos de alimentos grandes37,48, 49. Posteriormente, se administró una suspensión de 500 μL por sonda intragástrica a las ratas receptoras (Exp. 2). Para la CMT simulada (grupo de vehículo), las ratas recibieron una sonda intragástrica de 500 μl de PBS estéril para igualar el estrés de la manipulación con sonda durante los mismos días que los grupos de CMT.

Utilizamos un monitoreo longitudinal continuo, no invasivo, de la Tb central en el contexto fisiológico49,50. En resumen, Thermochron iButton, DS1922L-F5# (con una precisión de 0,0625 °C) se programó para comenzar a registrar Tb 1 semana después de la implantación a intervalos de 30 o 60 minutos y luego se cubrió con una fina capa de cera de parafina para impermeabilizar ( relación 3:1). El iButton se implantó quirúrgicamente en la cavidad peritoneal bajo anestesia general (inhalando 3-5% de isoflurano). Después de la cirugía, se devolvió a cada animal a su jaula de origen y se permitió que se recuperara durante 1 semana. Al final del experimento, se retiró el registrador del animal y se leyeron todos los registros utilizando el software OneWireViewer.

La tolerancia a la glucosa se evaluó mediante un método general descrito en estudios anteriores51. Brevemente, el día 30 del experimento, las ratas fueron alimentadas por vía oral con 2 g/kg de masa corporal de solución acuosa de glucosa esterilizada en ayunas (12 h) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Posteriormente, se tomaron muestras de sangre de la cola de las ratas mediante un pequeño rasguño y se determinaron los niveles de glucosa con un glucómetro (Accu-Chek Active; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) a 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la administración de glucosa.

Utilizamos kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para estimar los niveles en el suero, incluidos TSH (CSB-E05115r), triyodotironina libre (free-T3, CSB-E05076r), tiroxina (T4, CSB-E05082r), GLP-1 (CSB-E08117r), TNF-α (CSB-E11987r), grelina (CSB-E09816r) y LPS (CSB-E14247r) siguiendo las recomendaciones del fabricante (Cusabio, Wuhan, China). El método detallado para los ensayos de GLP-1 como ejemplo fue el siguiente52,53. El suero se trató primero con dipeptidil peptidasa inactivada, que se recubrió previamente sobre la superficie de una microplaca, y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Se añadió a la microplaca un segundo anticuerpo conjugado con biotina específico para unirse a GLP-1 y la incubación duró 1 hora a 37 °C. Luego, la peroxidasa de rábano picante conjugada con avidina se agregó a los pocillos y se incubó durante otra hora a 37 °C. Después de los lavados, se añadió una solución de sustrato a los pocillos y se desarrolló un color en proporción a la cantidad de unión de GLP-1 en el paso inicial. La absorbancia se midió con un lector ELISA (TECAN Spark, Greenmate Biotech Co, Suiza) a 450 nm. Los CV intra e interensayo fueron <15 % para los kits de T3 y T4 libres y en otros kits, los CV intra e interensayo fueron <8 % y <10 %, respectivamente.

El ARN total se extrajo del BAT y del intestino delgado usando reactivos Trizol (Bioline Reagent, Londres, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se cuantificó midiendo las densidades ópticas usando un espectrofotómetro de nanogotas (Implen, Munich, Alemania). El ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa de 1 μg de ARN extraído utilizando un cebador oligo-(dT) 18 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y el kit RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Corea). La PCR en tiempo real se realizó en un dispositivo Light Cycler480TM (Roche Applied Science, Basilea, Suiza) en una placa de 96 pocillos utilizando una mezcla maestra de PCR en tiempo real SYBR® Green (Toyobo, Tokio, Japón) y juegos de cebadores específicos para diferentes genes (Tabla complementaria 6). La expresión génica relativa se calculó mediante el método 2−ΔΔCt54, que se normalizó frente a la gliceraldehído-3-fosfatasa deshidrogenasa (GAPDH).

Los tejidos de íleon frescos se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4%. Después de embeberlas en cera de parafina, las muestras se seccionaron en serie a 4 μm con un micrótomo Leica RM2235 (Leica Microsystems, Nussloch, Alemania) y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Las secciones se observaron al microscopio óptico (BX61 Olympus, Tokio, Japón) con aumentos de 40x. Las imágenes del íleon se capturaron con una cámara digital (Olympus) y se visualizaron en una computadora conectada al microscopio. Los parámetros histológicos, como la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas en las secciones de tejido, se analizaron con el software ImageJ (Bethesda, MD, EE. UU.)51,55,56.

El ADN total se extrajo de los gránulos fecales utilizando el kit rápido de heces de ADN QIAamp® (Alemania) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La calidad y cantidad de ADN se detectó utilizando un espectrofotómetro de nanogotas (Implant, Munich, Alemania) midiendo la relación A260/A280. Solo se utilizaron ADN con una relación A260/A280 de 1,8–2,0 para la amplificación por PCR. Las regiones hipervariables V3–V4 del gen 16 S rRNA se amplificaron utilizando dos cebadores universales (341F–805 R) (Tabla complementaria 7, 8)37. Se realizó un análisis PCR para cada muestra de ADN por triplicado en el sistema termociclador (MiniAmp™ Thermal Cycler, Thermo Fisher). Los productos de PCR se comprobaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% (p/v) en tampón Tris, ácido bórico, ácido etilendiaminotetraacético teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Los productos de PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR rápido QIAamp® (Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se agruparon. Posteriormente, la secuenciación se realizó en un Illumina HiSeq 2500. El conjunto de datos de extremos emparejados de la secuencia 16 S se unió y la calidad se filtró mediante el método FLASH57. Después de la secuenciación, realizamos todos los análisis de secuenciación utilizando QIIME2 de acuerdo con el tutorial de QIIME (http://qiime.org/) con algunos métodos modificados. Las secuencias de filas se unieron y seleccionaron (se eliminaron las etiquetas de baja calidad y las quimeras que no cumplían con el requisito de longitud).

Los datos de ingesta de alimentos y masa de órganos se analizaron mediante análisis de covarianza unidireccional (ANCOVA) con la masa corporal como covariable. Las hormonas séricas, la Tb y otros datos de expresión de ARNm se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Las diferencias significativas entre los grupos se evaluaron adicionalmente mediante análisis post hoc y pruebas de diferencias mínimas significativas (LSD) cuando los efectos principales fueron significativos y cuando fue necesario. Se utilizó el software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.) para todos los análisis estadísticos. Los resultados se presentan como media ± SEM, y se consideró significativo un valor de p < 0,05. GraphPad Prism 7.04 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) se utilizó para crear gráficos.

Siguiendo los métodos anteriores con las modificaciones apropiadas48, evaluamos la riqueza y diversidad de la comunidad de bacterias (diversidad α) para Chao 1, observamos ASV, el índice de Shannon y el árbol completo de PD. PCoA estimó la diversidad β en función de la disimilitud de Bray-Curtis en las abundancias de ASV, y las diferencias estadísticas se determinaron mediante análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA). Las bacterias específicas se identificaron a través de STAMP58, y las diferencias significativas de grupo en las abundancias relativas de bacterias se examinaron mediante ANOVA unidireccional seguido de pruebas de LSD cuando fue necesario. Usamos el tamaño del efecto LDA junto con el método LEfSe para evaluar las diferencias en las comunidades microbianas usando un umbral de puntaje LDA de 2. Los diagramas de Venn se crearon usando jvenn59.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar de la secuencia del amplicón del gen 16 S rRNA están disponibles en el archivo de lectura de secuencias del NCBI con el acceso PRJNA938178.

Los códigos que se utilizaron en la secuenciación y el análisis del amplicón del gen 16 S rRNA están disponibles en el archivo de información complementaria.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Corea (2021H1D3A2A01098426), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32271575), el Programa de Investigación principal del Instituto de Investigación de Alimentos de Corea (KFRI) financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (número de subvención E0170600-06 ), una subvención del Proyecto de I+D de tecnología de la salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI) financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (HF20C0020) y por el programa Brain Pool financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2021H1D3A2A01098426). Nos gustaría agradecer al Dr. Qing-Sheng Chi por sus útiles sugerencias sobre el registro de la temperatura corporal y a Yura Choi, Mingyu Kim y Soo-Kyoung Lim por preparar las instalaciones del laboratorio durante los experimentos. También agradecemos a Jianfeng Wang por la ayuda con los análisis de datos de 16 S rDNA.

Estos autores contribuyeron por igual: Saeid Khakisahneh y Xue-Ying Zhang.

Departamento de Medicina de Rehabilitación de Medicina Coreana, Universidad Dongguk, 814 Siksa-dong, Ilsandong-gu, Goyang-si, 10326, República de Corea

Saeid Khakisahneh, Song-Yi Han y Hojun Kim

Laboratorio Estatal Clave de Manejo Integrado de Plagas de Insectos y Roedores, Instituto de Zoología, Academia de Ciencias de China, Beijing, 100101, China

Xue Ying Zhang

Centro CAS para la Excelencia en Interacciones Bióticas, Universidad de la Academia de Ciencias de China, Beijing, 100049, China

Xue Ying Zhang

Grupo de Investigación del Microbioma Intestinal, Instituto de Investigación Alimentaria de Corea, Wanju-gun, 245, República de Corea

Eun-Ji Song y Young-Do Nam

Departamento de Biotecnología Alimentaria, Universidad de Ciencia y Tecnología de Corea, Wanju, República de Corea

Eun-Ji Song y Young-Do Nam

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HK, XYZ y SK concibieron el estudio y diseñaron los experimentos. SK realizó los experimentos. SYH y EJS colaboraron en el trabajo técnico de laboratorio. XYZ y SK analizaron los datos. SK y XYZ escribieron el manuscrito original. XYZ, HK y YDN revisaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final. SK y XYZ contribuyeron igualmente a este trabajo.

Correspondencia a Young-Do Nam o Hojun Kim.

Los autores no revelan ningún conflicto de interés.

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Khakisahneh, S., Zhang, XY., Han, SY. et al. Yijung-tang mejora la termogénesis y reduce la inflamación asociada con la microbiota intestinal en ratas hipotiroideas. npj Biofilms Microbiomes 9, 32 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00396-2

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Recibido: 07 enero 2023

Aceptado: 10 de mayo de 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00396-2

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